殺虫剤抵抗性イエバエ、イエバエのカルボキシルエステラーゼの機能特性
Summary
ここでは、プロトコルを提案家フライ カルボキシルエステラーゼ タンパク質の in vitroバキュロ ウイルス媒介昆虫細胞発現系を生成し、後で機能的、それにより代謝ペルメトリンの役割を特徴づけるピレスロイドを授与セルベースの MTT アッセイと体外代謝研究を行うことにより抵抗。
Abstract
カルボキシルエステラーゼを介した代謝は、さまざまな昆虫の殺虫剤抵抗性に大きな役割を果たすと考えられます。いくつかのカルボキシルエステラーゼ遺伝子は、探検するために殺虫剤耐性での役割が残っているに対し、抵抗性イエバエ フライひずみの調整を発見されました。ここでは、我々 はカルボキシルエステラーゼの機能解析のためのプロトコルを設計しました。3 つの例の実験を紹介する: (1) 式とバキュロ ウイルス媒介昆虫ハスモンヨトウ frugiperda (Sf9) セル式システムによるカルボキシルエステラーゼ タンパク質の分離(2) の細胞ベースの MTT (3-[4, 5-dimethykthiazol-2-イル]-2, 5-diphenyltetrazolium ブロマイド) 異なるペルメトリン治療昆虫細胞の耐性を測定する細胞毒性アッセイ(3)の in vitro代謝の研究ペルメトリンに向かってカルボキシルエステラーゼの代謝機能を調査します。MdαE7 抵抗性イエバエから複製されたカルボキシルエステラーゼ遺伝子系統 ALHF を飛ぶし、Sf9 細胞感染の組換えバキュロ ウイルスを作成するために使用します。異なるペルメトリン治療に対してセル目は、MTT アッセイを測定しました。パーメスリン抵抗性制御グループ (猫組換えバキュロ ウイルス感染細胞と GFP 遺伝子組換えバキュロ ウイルス感染細胞) の比較実験グループ (MdαE7 組換えバキュロ ウイルス感染細胞) の高められた細胞トレランス治療は、それにより化学損傷から細胞を保護する殺虫剤の代謝で MdαE7 の機能を提案しました。それに加えて、カルボキシルエステラーゼ蛋白質は昆虫 Sf9 細胞で発現され分離体外代謝研究を行うこと。かなりの in vitro代謝効率 MdαE7 のペルメトリン、殺虫剤の代謝でカルボキシルエステラーゼの関与を示す直接の方が示唆し、飛ぶため殺虫剤抵抗性の家を授与します。
Introduction
殺虫剤抵抗性は現在家はえ制御世界中1,2の主要な問題であります。殺虫剤抵抗性のメカニズムを容易にこの問題のより良い理解を決定するため、新しい戦略を効果的に防止したり、抵抗の開発3の拡散を最小限に努力。カルボキシルエステラーゼ、主要な解毒酵素の一つとして、多くの隔離と様々 な昆虫4,5,6の殺虫剤の代謝における役割のため注目を集めています。私たちの以前の研究は家のハエで複数カルボキシルエステラーゼを識別しているの発現量恒常耐性 ALHF 株にまで規制がありませんがまたペルメトリン治療7 への応答で高い誘導のレベルをすることができます。.ただし、殺虫剤の代謝におけるこれらのカルボキシルエステラーゼ遺伝子の機能的な特徴は、探検するために残ります。
初期の 1980 年代8の最初のレポート以来高蛋白質生産効率性真核生物のタンパク質のプロセッシング機能9バキュロ ウイルスを介する遺伝子発現システムに広く採用されています。このバイナリ システムは 2 つの本質的な要素で構成される: 構築された組換えバキュロ ウイルスの宿主細胞と遺伝子組換えバキュロ ウイルスによる感染細胞による興味のあるタンパク質の大量発現に外国の遺伝子を提供します。過去十年にわたってバキュロ ウイルス媒介電池式システムは、組換えタンパク質、細胞質酵素から昆虫の膜結合型蛋白質に至るまでの数千を生成する広く使用されています、哺乳類細胞の10。私たちの以前の研究は正常にこのシステム11Sf9 昆虫細胞での複数の CYP450 酵素を表明しています。本研究で我々 は Sf9 昆虫細胞に感染するカルボキシルエステラーゼ組換えバキュロ ウイルスを構築、異なるペルメトリン治療し、大規模な表現カルボキシルエステラーゼ タンパク質の in vitroの免疫寛容を検討機能探査。以前研究12,13で採択された「昆虫ホモジュネートからの複数のカルボキシルエステラーゼ アイソザイムの混合物を調査して、代わりこのバキュロ ウイルス媒介昆虫細胞発現系により特定の式とターゲットタンパク質の生化学的および構造特性より良い評価のための分離。
テトラゾリウム塩を用いた測定 (MTT) は、高スループットの比色定量法を開発し、細胞生存率を測定するために最適化されました。このアッセイは、生細胞のみがこの分析できる有機溶剤14に溶解した後、暗い紫色着色された塩の沈殿物に黄色の MTT の試薬を代謝できるメカニズムに基づいています 15。トリパン ブルー色素排除とチミジン滴定分析16,17などの時間のかかる方法がより正確なのいくつかは近年開発されています。ただし、MTT の細胞に基づく試金はまだ現在、細胞生存率を迅速に検出する最も迅速かつ簡単に操作の方法として認識されます。ここでは、MTT の試金を使用殺虫剤の治療に対して免疫寛容を探索します。強くカルボキシルエステラーゼ組換えバキュロ ウイルスに感染している場合に、セルの強化されたトレランスは、順番で殺虫剤抵抗性への関与を示唆している殺虫剤、カルボキシルエステラーゼの代謝の役割をサポートします。
さらに、体外代謝アッセイは、この研究も行われました。カルボキシルエステラーゼの加水分解の活動を反映するように α ラウリン酢酸 (α-NA) と β-ナフチル酢酸 (β-NA) などの一般的な基材を使用して一般的なカルボキシルエステラーゼの試金と比較して、体外代謝研究は正確な方法とみなされる殺虫剤18に向かってカルボキシルエステラーゼの活動を直接測定します。このメソッドは正常に様々 な昆虫の殺虫剤抵抗11,19,20協会における複数チトクロム p450 の特性評価に採用されています。ただし、このメソッドがまだ適用されていないカルボキシルエステラーゼの研究。バキュロ ウイルスによる発現システムによって生成するカルボキシルエステラーゼ タンパク質の可用性、我々 の関与の強力な証拠を提供することができます。 さらにペルメトリンに向かってカルボキシルエステラーゼの体外代謝研究を実行できます。ピレスロイド耐性を家の中でカルボキシルエステラーゼのハエします。
Protocol
Representative Results
Discussion
最近数十年で表現し、大量の蛋白質の生化学的, 機能的定量法と体外酵素の特性をこのように分離異種発現システムに広く使用されています。日には、大腸菌、 ・組成分析、 Sacccharomyces 酵母、ハスモンヨトウ frugiperdaなどいくつかの別のモデル システムは組換え蛋白質の表現との選択に適応されている、興味の蛋白質22,<sup class="xref…
Materials
| Q5 High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs inc. | M0491L | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 | |
| pENTR/D-TOPO Cloning Kit, with One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli | Invitrogen by life technology | K240020 | S.O.C medium and universal M13 sequence primers were included in this kit. |
| PureLink HiPure Plasmid Miniprep Kit | Invitrogen by life technology | K210002 | |
| Gateway LR Clonase II Enzyme mix for BaculoDirectTM Kits | Invitrogen by life technology | 11791-023 | |
| BaculoDirect C-Term Linear DNA Transfection Kit | Invitrogen by life technology | 12562-019 | Cellfectin transfection reagent and ganciclovir were included in this kit |
| pENTR-CAT plasmid | Invitrogen by life technology | Included in BaculoDirect C-Term Linear DNA Transfection Kit, concentration: 0.5 ug/uL | |
| Heat inactivated Fetal Bovine Serum, Certified | Gibco by Life Technologies | 10082-139 | |
| Sf9 cells in Sf-900 III SFM | Gibco by Life Technologies | 12659017 | |
| Insect Cell-PE LB Insect Cell Protein Extraction & Lysis Buffer | G Biosciences by A Geno Technology Inc | 786-411 | |
| Sf-900 III SFM (1×) Serum Free Medium Complete | Gibco by Life Technologies | 12658-019 | |
| Grace's Insect Medium, unsupplemented | Gibco by Life Technologies | 11595030 | |
| Permethrin (isomers) analytical standard | SUPELCO by Solutions WithinTM | 442748 | |
| Methanol (analytical graded) | Sigma-Aldrich | 67-56-1 | |
| Acetonitrile (analytical graded) | Sigma-Aldrich | 75-05-8 | |
| GHP Acrodisc 25 mm Syringe Filters with 0.45 μm GHP Membrane (HPLC Certified) | Pall Life Sciences | 21890388 | |
| Alliance Waters 2695 HPLC System | Waters | ||
| T100 Thermal Cycle | Bio-Rad Laboratories Inc. | 1861096 | |
| Nanodrop 2000/2000c Spectrophotometers | ThermoFisher Scientific | ND2000CLAPTOP | |
| Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader | BioTek |
References
- Scott, J. G., et al. Insecticide resistance in house flies from the United States: Resistance levels and frequency of pyrethroid resistance alleles. Pesticide Biochemistry and Physiology. 107 (3), 377-384 (2013).
- Li, M., et al. A whole transcriptomal linkage analysis of gene co-regulation in insecticide resistant house flies, Musca domestica. BMC Genomics. 14, 803 (2013).
- Liu, N. Insecticide resistance in mosquitoes: impact, mechanisms, and research directions. Annual Review of Entomology. 60, 537-559 (2015).
- Grigoraki, L., et al. Transcriptome profiling and genetic study reveal amplified carboxylesterase genes implicated in temephos resistance, in the Asian tiger mosquito Aedes albopictus. e0003771. 9, e0003771 (2015).
- Grigoraki, L., et al. Carboxylesterase gene amplifications associated with insecticide resistance in Aedes albopictus: Geographical distribution and evolutionary origin. PLOS Neglected Tropical Diseases. 11, e0005533 (2017).
- Wheelock, C., Shan, G., Ottea, J. Overview of carboxylesterases and their role in the metabolism of insecticides. Journal of Pesticide Science. 30, 75-83 (2005).
- Feng, X., Li, M., Liu, N. Carboxylesterase genes in pyrethroid resistant house flies, Musca domestica. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 92, 30-39 (2018).
- Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
- Jarvis, D. L. Baculovirus-insect cell expression systems. Methods in Enzymology. 463, 191-222 (2009).
- Berger, I., Fitzgerald, D. J., Richmond, T. J. Baculovirus expression system for heterologous multiprotein complexes. Nature Biotechnology. 22 (12), 1583 (2004).
- Gong, Y., Li, T., Feng, Y., Liu, N. The function of two P450s, CYP9M10 and CYP6AA7, in the permethrin resistance of Culex quinquefasciatus. Scientific Reports. 7 (1), 587 (2017).
- Cao, C. W., Zhang, J., Gao, X. W., Liang, P., Guo, H. L. Overexpression of carboxylesterase gene associated with organophosphorous insecticide resistance in cotton aphids, Aphis gossypii (Glover). Pesticide Biochemistry and Physiology. 90 (3), 175-180 (2008).
- Zhang, L., Gao, X., Liang, P. Beta-cypermethrin resistance associated with high carboxylesterase activities in a strain of house fly, Musca domestica (Diptera: Muscidae). Pesticide Biochemistry and Physiology. 89, 65-72 (2007).
- Van Meerloo, J., Kaspers, G. J., Cloos, J. Cell sensitivity assays: the MTT assay. Cancer cell culture. , 237-245 (2011).
- Stockert, J. C., Blázquez-Castro, A., Cañete, M., Horobin, R. W., Villanueva, &. #. 1. 9. 3. ;. MTT assay for cell viability: Intracellular localization of the formazan product is in lipid droplets. Acta Histochemica. 114 (8), 785-796 (2012).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. , (2001).
- Riss, T. L., Moravec, R. A., Niles, A. L., Duellman, S., Benink, H. A., Worzella, T. J., Minor, L. Cell viability assays. Assay Guidance Manual. , (2013).
- Wheelock, C. E., Shan, G., Ottea, J. Overview of carboxylesterases and their role in the metabolism of insecticides. Journal of Pesticide Science. 30 (2), 75-83 (2005).
- Li, X., Schuler, M. A., Berenbaum, M. R. Molecular mechanisms of metabolic resistance to synthetic and natural xenobiotics. Annual Review of Entomology. 52, 231-253 (2007).
- Nakamura, Y., et al. The in vitro metabolism of a pyrethroid insecticide, permethrin, and its hydrolysis products in rats. Toxicology. 235 (3), 176-184 (2007).
- Kruger, N. J. The Bradford method for protein quantitation. The protein protocols handbook. , 15-21 (2002).
- Macauley-Patrick, S., Fazenda, M. L., McNeil, B., Harvey, L. M. Heterologous protein production using the Pichia pastoris expression system. Yeast. 22 (4), 249-270 (2005).
- Berger, I., Fitzgerald, D. J., Richmond, T. J. Baculovirus expression system for heterologous multiprotein complexes. Nature Biotechnology. 22 (12), 1583 (2004).
- Terpe, K. Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Applied Microbiology and Biotechnology. 72 (2), 211 (2006).
- Bulter, T., et al. Functional expression of a fungal laccase in Saccharomyces cerevisiae by directed evolution. Applied Microbiology and Biotechnology. 69 (2), 987-995 (2003).
- Stepanenko, A. A., Dmitrenko, V. V. Pitfalls of the MTT assay: Direct and off-target effects of inhibitors can result in over/underestimation of cell viability. Gene. 574 (2), 193-203 (2015).
