Carboxylesterases böcek ilacı dayanıklı ev sinekleri, sinek Domestica içinde işlevsel karakterizasyonu
Summary
Burada, bir aracılı baculovirus böcek hücre ifade sistemi ile ev sinek carboxylesterase proteinler vitro üretmek ve daha sonra işlevsel olarak Permetrin, metabolize onların rolleri böylece, karakterize bir protokol pyrethroid veriyor mevcut rezistansının hücre tabanlı MTT tahlil ve vitro metabolik çalışmalar yürütmektedir.
Abstract
Carboxylesterase-aracılı metabolizma çeşitli böcek böcek ilacı direnci önemli bir rol oynamaktadır düşünülmektedir. Böcek ilacı direnci veriyor onların rolleri keşfedilmeyi kaldı, ancak birkaç carboxylesterase genler dayanıklı ev sinek gerginliği, yukarı düzenlenir bulunamadı. Burada, biz bir protokol carboxylesterases fonksiyonel karakterizasyonu için tasarlanmıştır. Üç örnek deneyler sunulmaktadır: (1) ifade ve yalıtım carboxylesterase protein aracılığıyla bir baculovirus-aracılı böcek Spodoptera frugiperda (Sf9) hücre ifade sistemi; (2) bir hücre tabanlı MTT (3-[4, 5-dimethykthiazol-2-yl] -2, 5-diphenyltetrazolium bromür) böcek hücreleri toleransları farklı Permetrin tedavilere; ölçmek için sitotoksisite tahlil ve carboxylesterases doğru Permetrin metabolik yeteneklerini keşfetmek için (3) vitro metabolik çalışmaları. MdαE7 dayanıklı bir evden klonlanmış carboxylesterase gen soy ALHF sinek ve Sf9 hücreleri enfeksiyon için rekombinant baculovirus oluşturmak için kullanılan. Hücre viabilities farklı Permetrin tedaviler karşı MTT tahlil ile ölçüldü. Permetrin için denetim gruplarının (kedi-rekombinant baculovirus enfekte hücreleri ve GFP-rekombinant baculovirus enfekte hücreleri) ile karşılaştırıldığında deney grubu (MdαE7-rekombinant baculovirus enfekte hücreleri) Gelişmiş hücre toleransları tedaviler MdαE7 yeteneklerini böylece hücrelerin kimyasal zararlardan korunması, böcek öldürücüler, metabolize önerdi. Bunun yanı sıra, carboxylesterase proteinler böcek Sf9 hücrelerde ifade ve vitro metabolik çalışma yapmak için izole. Bizim sonuçları önemli vitro bir metabolik verimlilik MdαE7 Permetrin, doğrudan böcek ilaçları metabolize içinde carboxylesterases tutulumu gösteren doğru belirtilen ve böylece evde böcek ilacı direnci veriyor uçar.
Introduction
Böcek ilacı direnç Şu anda evi sinek denetim dünya çapında1,2önemli bir konudur. Böcek ilacı direnç mekanizmasının belirlemek için çabaları bu konunun daha iyi anlamayı kolaylaştırır ve böylece etkili önlemek veya direnç geliştirme3yayılmasını en aza indirmek için roman stratejileri sağlamak. Carboxylesterases, bir büyük detoksifikasyon enzimler olarak iyon ve böcek öldürücüler çeşitli böcekler4,5,6metabolize rolleri için ilgi çok çekmiştir. Bizim önceki çalışma evi sinekler içinde birden çok carboxylesterases tespit etti ve onların ifade düzeyleri sadece yapısal dayanıklı ALHF zorlanma yukarı düzenlenir değildi ama aynı zamanda yanıt olarak Permetrin tedaviler7 indüklenen için daha yüksek düzeyde olabilir . Ancak, böcek ilaçları metabolize içinde bu carboxylesterase gen işlevsel karakterizasyonu keşfedilmeyi kalır.
Erken 1980’li yıllarda8ilk raporda beri yabancı gen baculovirus-aracılı ifade sistem yaygın olarak yüksek protein üretim verimliliği ve ökaryotik protein yetenekleri9işleme nedeniyle istihdam edilmiştir. Bu ikili sistem iki temel unsurdan oluşur: konak hücreleri ve büyük ölçekli ifade rekombinant baculovirus tarafından enfekte hücreleri tarafından baktılar proteinlerin içine yabancı gen teslim inşa rekombinant baculovirus. Son on yıl boyunca baculovirus aracılı hücre ifade sistem yaygın rekombinant proteinler membran bağlı proteinler arasında böcek sitozolik enzimler arasında değişen, binlerce üretmek için kullanılmıştır ve10memeli hücreleri. Bizim önceki çalışma başarıyla birden fazla CYP450 enzimleri bu sistem11ile böcek Sf9 hücrelerdeki dile getirdi. Bu çalışmada, böcek Sf9 hücre bulaştırmak için bir carboxylesterase-rekombinant baculovirus inşa, farklı Permetrin tedaviler ve büyük ölçekli ifade carboxylesterase proteinler vitro için hücre tolerans incelenmiştir fonksiyonel keşif. Önceki çalışmalar12,13tarafından kabul edilen birden çok carboxylesterase izozim karışımları böcek homogenates üzerinden araştıran yerine, bu böcek hücre baculovirus-aracılı ifade sistemi belirli ifade sağlar ve biyokimyasal ve yapısal özelliklerini daha iyi karakterizasyonu için hedeflenen proteinlerin yalıtım.
Tetrazolium tuz tabanlı tahlil (MTT) geliştirilen ve hücre canlılığı ölçmek için optimize edilmiş yüksek üretilen iş kolorimetrik yöntemi olduğunu. Bu tahlil sadece canlı hücreler sarı renkli MTT reaktif colorimetrically sonra çözünmüş organik çözücüler14‘analiz edilebilir bir koyu mor renkli formazan çökelti için metabolize yeteneğine mekanizması dayanır, 15. Birkaç daha doğru ama Trypan mavi dışlama ve timidin titrasyon tahlil16,17, gibi zaman alan yöntemleri son yıllarda geliştirilmiştir. Ancak, hücre tabanlı MTT tahlil hala şu anda hızlı bir şekilde hücre canlılığı algılamak için en hızlı ve kolay işletilen yöntemi olarak tanınır. Burada, böcek ilacı tedaviler karşı hücre tolerans keşfetmek için MTT tahlil kullanırız. Güçlü carboxylesterase rekombinant baculovirus ile enfekte hücreleri geliştirilmiş dayanıklılık için böcek öldürücüler, buna karşılık onların katılımı böcek ilacı direnç www.cdc.gov/drugresistance öneriyor carboxylesterases metabolik rolleri destekleyen.
Ayrıca, bir vitro metabolik tahlil de bu çalışma yapılmıştır. Carboxylesterases hydrolytic faaliyetleri yansıtmak için α-napthyl asetat (α-NA) ve β-naftil asetat (β-NA) gibi ortak yüzeylerde kullanın genel carboxylesterase deneyleri ile karşılaştırıldığında, vitro metabolik çalışma doğru bir yol kabul edilmektedir doğrudan carboxylesterases böcek öldürücüler18doğru faaliyetlerinin ölçmek için. Bu yöntem başarılı bir şekilde çeşitli böcek böcek ilacı direnç11,19,20ile birlikte birden çok sitokrom P450s karakterize etmek için istihdam edilmiştir. Ancak, bu yöntem henüz carboxylesterase çalışmalarda uygulanmamıştır. Baculovirus-aracılı ifade sistem tarafından üretilen carboxylesterase proteinler durumu ile daha da güçlü kanıtı sağlayabilir Permetrin doğru carboxylesterases bir vitro metabolik çalışma gerçekleştirebilirsiniz pyrethroid direnç içinde ev veriyor, carboxylesterases, uçar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Son yıllarda, kapaklı ifade sistemleri yaygın olarak hızlı ve büyük miktarda protein, böylece biyokimyasal ve fonksiyonel belirlenmesi ve enzimler vitrokarakterizasyonu izin izole etmek için kullanılmıştır. Bugüne kadar Escherichia coli, Pichia pastoris, Sacccharomyces cerevisiaeve Spodoptera frugiperda gibi birkaç farklı model sistemleri Rekombinant protein ifade ve seçim için adapte edilmiştir vitro sistem baktılar proteinler22<…
Materials
| Q5 High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs inc. | M0491L | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 | |
| pENTR/D-TOPO Cloning Kit, with One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli | Invitrogen by life technology | K240020 | S.O.C medium and universal M13 sequence primers were included in this kit. |
| PureLink HiPure Plasmid Miniprep Kit | Invitrogen by life technology | K210002 | |
| Gateway LR Clonase II Enzyme mix for BaculoDirectTM Kits | Invitrogen by life technology | 11791-023 | |
| BaculoDirect C-Term Linear DNA Transfection Kit | Invitrogen by life technology | 12562-019 | Cellfectin transfection reagent and ganciclovir were included in this kit |
| pENTR-CAT plasmid | Invitrogen by life technology | Included in BaculoDirect C-Term Linear DNA Transfection Kit, concentration: 0.5 ug/uL | |
| Heat inactivated Fetal Bovine Serum, Certified | Gibco by Life Technologies | 10082-139 | |
| Sf9 cells in Sf-900 III SFM | Gibco by Life Technologies | 12659017 | |
| Insect Cell-PE LB Insect Cell Protein Extraction & Lysis Buffer | G Biosciences by A Geno Technology Inc | 786-411 | |
| Sf-900 III SFM (1×) Serum Free Medium Complete | Gibco by Life Technologies | 12658-019 | |
| Grace's Insect Medium, unsupplemented | Gibco by Life Technologies | 11595030 | |
| Permethrin (isomers) analytical standard | SUPELCO by Solutions WithinTM | 442748 | |
| Methanol (analytical graded) | Sigma-Aldrich | 67-56-1 | |
| Acetonitrile (analytical graded) | Sigma-Aldrich | 75-05-8 | |
| GHP Acrodisc 25 mm Syringe Filters with 0.45 μm GHP Membrane (HPLC Certified) | Pall Life Sciences | 21890388 | |
| Alliance Waters 2695 HPLC System | Waters | ||
| T100 Thermal Cycle | Bio-Rad Laboratories Inc. | 1861096 | |
| Nanodrop 2000/2000c Spectrophotometers | ThermoFisher Scientific | ND2000CLAPTOP | |
| Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader | BioTek |
References
- Scott, J. G., et al. Insecticide resistance in house flies from the United States: Resistance levels and frequency of pyrethroid resistance alleles. Pesticide Biochemistry and Physiology. 107 (3), 377-384 (2013).
- Li, M., et al. A whole transcriptomal linkage analysis of gene co-regulation in insecticide resistant house flies, Musca domestica. BMC Genomics. 14, 803 (2013).
- Liu, N. Insecticide resistance in mosquitoes: impact, mechanisms, and research directions. Annual Review of Entomology. 60, 537-559 (2015).
- Grigoraki, L., et al. Transcriptome profiling and genetic study reveal amplified carboxylesterase genes implicated in temephos resistance, in the Asian tiger mosquito Aedes albopictus. e0003771. 9, e0003771 (2015).
- Grigoraki, L., et al. Carboxylesterase gene amplifications associated with insecticide resistance in Aedes albopictus: Geographical distribution and evolutionary origin. PLOS Neglected Tropical Diseases. 11, e0005533 (2017).
- Wheelock, C., Shan, G., Ottea, J. Overview of carboxylesterases and their role in the metabolism of insecticides. Journal of Pesticide Science. 30, 75-83 (2005).
- Feng, X., Li, M., Liu, N. Carboxylesterase genes in pyrethroid resistant house flies, Musca domestica. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 92, 30-39 (2018).
- Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
- Jarvis, D. L. Baculovirus-insect cell expression systems. Methods in Enzymology. 463, 191-222 (2009).
- Berger, I., Fitzgerald, D. J., Richmond, T. J. Baculovirus expression system for heterologous multiprotein complexes. Nature Biotechnology. 22 (12), 1583 (2004).
- Gong, Y., Li, T., Feng, Y., Liu, N. The function of two P450s, CYP9M10 and CYP6AA7, in the permethrin resistance of Culex quinquefasciatus. Scientific Reports. 7 (1), 587 (2017).
- Cao, C. W., Zhang, J., Gao, X. W., Liang, P., Guo, H. L. Overexpression of carboxylesterase gene associated with organophosphorous insecticide resistance in cotton aphids, Aphis gossypii (Glover). Pesticide Biochemistry and Physiology. 90 (3), 175-180 (2008).
- Zhang, L., Gao, X., Liang, P. Beta-cypermethrin resistance associated with high carboxylesterase activities in a strain of house fly, Musca domestica (Diptera: Muscidae). Pesticide Biochemistry and Physiology. 89, 65-72 (2007).
- Van Meerloo, J., Kaspers, G. J., Cloos, J. Cell sensitivity assays: the MTT assay. Cancer cell culture. , 237-245 (2011).
- Stockert, J. C., Blázquez-Castro, A., Cañete, M., Horobin, R. W., Villanueva, &. #. 1. 9. 3. ;. MTT assay for cell viability: Intracellular localization of the formazan product is in lipid droplets. Acta Histochemica. 114 (8), 785-796 (2012).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. , (2001).
- Riss, T. L., Moravec, R. A., Niles, A. L., Duellman, S., Benink, H. A., Worzella, T. J., Minor, L. Cell viability assays. Assay Guidance Manual. , (2013).
- Wheelock, C. E., Shan, G., Ottea, J. Overview of carboxylesterases and their role in the metabolism of insecticides. Journal of Pesticide Science. 30 (2), 75-83 (2005).
- Li, X., Schuler, M. A., Berenbaum, M. R. Molecular mechanisms of metabolic resistance to synthetic and natural xenobiotics. Annual Review of Entomology. 52, 231-253 (2007).
- Nakamura, Y., et al. The in vitro metabolism of a pyrethroid insecticide, permethrin, and its hydrolysis products in rats. Toxicology. 235 (3), 176-184 (2007).
- Kruger, N. J. The Bradford method for protein quantitation. The protein protocols handbook. , 15-21 (2002).
- Macauley-Patrick, S., Fazenda, M. L., McNeil, B., Harvey, L. M. Heterologous protein production using the Pichia pastoris expression system. Yeast. 22 (4), 249-270 (2005).
- Berger, I., Fitzgerald, D. J., Richmond, T. J. Baculovirus expression system for heterologous multiprotein complexes. Nature Biotechnology. 22 (12), 1583 (2004).
- Terpe, K. Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Applied Microbiology and Biotechnology. 72 (2), 211 (2006).
- Bulter, T., et al. Functional expression of a fungal laccase in Saccharomyces cerevisiae by directed evolution. Applied Microbiology and Biotechnology. 69 (2), 987-995 (2003).
- Stepanenko, A. A., Dmitrenko, V. V. Pitfalls of the MTT assay: Direct and off-target effects of inhibitors can result in over/underestimation of cell viability. Gene. 574 (2), 193-203 (2015).
