Vi har utviklet en strategi for å rense og bilde et stort antall centrioles i forskjellige retninger mottakelig for super-oppløsning mikroskopi og enkelt-partikkel snitt.
Centrioles er store macromolecular samlinger viktig for riktig gjennomføring av grunnleggende celle biologiske prosesser som celledeling, celle motilitet eller celle signalisering. Grønn algene Chlamydomonas reinhardtii har vist seg for å være en innsiktsfull modell i studiet av centriole arkitektur, funksjon og protein komposisjon. Til tross for store fremskritt mot forståelse centriolar arkitektur er en i aktuelle utfordringer å bestemme den nøyaktige lokaliseringen av centriolar komponenter i strukturelle deler av centriole for å bedre forstå deres rolle i centriole biogenesis. En stor begrensning ligger i oppløsningen til fluorescens mikroskopi, kompliserer tolkningen av protein lokalisering i denne organelle med dimensjoner nær Diffraksjon grensen. For å takle dette spørsmålet, gir vi en metode for å rense og bilde et stort antall C. reinhardtii centrioles med forskjellige retninger med super-oppløsning mikroskopi. Denne teknikken kan videre behandling gjennom fluorescerende single-partikkel gjennomsnitt (Fluo-SPA) på grunn av det store antallet centrioles kjøpt. Fluo-SPA genererer gjennomsnitt av farget C. reinhardtii centrioles i forskjellige retninger, dermed tilrettelegge lokalisering av forskjellige proteinene i centriolar regioner. Viktigere, kan denne metoden brukes på bildet centrioles fra andre arter eller andre store macromolecular samlinger.
Centriole er et evolusjonært bevarte organelle som ligger i kjernen av centrosome i dyreceller og kan fungere som en basal kropp (referert til som centrioles heretter) mal flimmerhårene eller flagella i mange eukaryoter1,2. Slik er centrioles kritiske for grunnleggende celle biologiske prosesser fra spindelen montering til celle signalisering. Derfor er mangler i centriole samling eller funksjonen forbundet med flere menneskelige patologi inkludert ciliopathies og kreft3.
Centrioles er nine-fold, symmetrisk, microtubule trilling-baserte sylindriske strukturer som er vanligvis ~ 450 nm lang og ~ 250 nm bred4,5,6,7. Konvensjonelle elektronmikroskop og cryo-elektron tomografi av centrioles fra ulike arter har avdekket at centrioles er polarisert langs deres lange aksen med tre forskjellige områder: et proksimale område, en sentral kjerne og en distale regionen5 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11. viktigst, hver av disse områdene viser strukturelle funksjoner. Først inneholder lumen i 100 nm lange proksimale regionen cartwheel strukturen koblet til microtubule trilling gjennom pinhead element12. Andre 300-400 nm lange sentrale regionen inneholder fibrøs tettheter i funksjonene lumen og strukturelle langs indre ansiktet de piskehale som henger: Y-formet linker, C-tubule halen og A-tubule spire9. Til slutt, 50-100 nm distale regionen utstillinger sub distale og distale vedheng som omgir den distale del av centriole5,13.
De to siste tiårene har vært preget av oppdagelsen av et økende antall centriolar proteiner, fører til en gjeldende estimering av 100 distinkt proteiner blir en del av centriole14,15,16, 17. til tross for disse fremskrittene den nøyaktige lokaliseringen av disse proteinene i centriole forblir unnvikende, spesielt innen strukturelle regioner. Viktigere, er tilordne en nøyaktig lokalisering til strukturelle deler av centriole avgjørende for en bedre forståelse av deres funksjon. I denne forbindelse har C. reinhardtii centrioles vært medvirkende i begge sider av første delimitating forskjellige strukturfunksjonene langs sylinder9,18,19, som deretter lot forskere å korrelere lokalisering av et delsett av proteiner med fluorescerende mikroskopi en sub strukturelle regionen. Dette omfatter for eksempel proteiner Bld12p og Bld10p, som Lokaliser den proksimale regionen og cartwheel strukturen spesielt20,21,22,23. Listen over underkonstruksjonen lokalisert proteiner inkluderer også POB15 og POC16, to nye proteiner identifisert av massespektrometri som dekorerer regionen indre sentrale kjernen C. reinhardtii centrioles17.
Dette dokumentet gir en fullstendig beskrivelse av metoden utviklet for å isolere og image C. reinhardtii centrioles for påfølgende super-oppløsning mikroskopi og enkelt-partikkel snitt. For å oppnå dette målet, er det viktig å avgrense de tekniske begrensningene som må overvinnes. Først kan centriole rensing påvirke den generelle arkitekturen, med cartwheel struktur ofte blir tapt i de ulike trinnene i isolasjon9. Dernest er centriole svært nær Diffraksjon grensen i optisk mikroskopi. Lateral oppløsningen som kan oppnås i AC confocal mikroskopi er faktisk rundt 200 nm24, lik diameteren på centriole og oppløsningen i z-aksen er om 2-3 x lavere, fører til en Anisotrop volum. For det tredje, heterogenitet antistoff merking og centriole orientering kan begrense tolkningen trengs for å lokalisere et protein i en bestemt centriolar regionen. Endelig finnes centrioles i bare to eksemplarer per celle, gjør det vanskelig å få et stort antall bilder og finne en entydig centriole retning. For å omgå disse tekniske problemer, utviklet vi en metode som baserer seg på bruk av super-oppløsning mikroskopi på et stort antall isolerte centrioles som vedta ulike retninger. Først vil vi beskrive en protokoll for å rense C. reinhardtii centrioles som rensing av strukturelt intakt centrioles og procentrioles som inneholder cartwheel. Deretter vil vi beskrive en trinnvis protokoll for å fokusere på centrioles på coverslips for avbildning av konvensjonelle eller fluorescerende super-oppløsning mikroskopi. Dette viktig skritt kan øke antall centrioles fotografert i flere retninger. Til slutt vil vi beskrive en prosedyre for å utføre single-partikkel snitt på informasjon innhentet ved fluorescerende mikroskop som forenkler gjenkjenning av centrioles i forskjellige retninger. Helt, kan denne metoden brukes på bildet centrioles fra ulike arter eller andre store macromolecular samlinger.
En av utfordringene i biologi er å dechiffrere den nøyaktige lokaliseringen av proteiner i arkitektonisk sammenheng. Centriole er en ideell struktur bruke disse metodene, som sin arkitektur har studert ved bruk av cryo-elektron tomografi, avslørende interessante ultrastructural funksjoner langs. Men fordi dimensjoner nær oppløsning grensen i optisk mikroskopi er det vanskelig å nøyaktig lokalisere et protein av immunofluorescence til en strukturell sub regionen centriole bruker konvensjonell mikroskop30.
Oppløsningen i optisk mikroskopi er begrenset av Diffraksjon lys som gir, grovt, lateral maksimal oppløsning på 200 nm i optisk mikroskopi24. Men denne grensen har vært består av en av de store gjennombrudd i de siste 20 årene i optisk mikroskopi: oppfinnelsen av super-oppløsning metoder. Disse metodene kan bildet utover Diffraksjon grensene i forskjellige oppløsninger: 120 nm for SIM, 50 nm for tilsvarende nedbryting (STED) og 20-40-nm for single-molekylet lokalisering mikroskopi (SMLM)24. Med denne nye utviklingen av super-oppløsning mikroskopi er de strukturelle underregionene av centriole oppnåelig. Men i praksis er det fortsatt vanskelig å nøyaktig bestemme lokaliseringen av et protein til en strukturell element for den viktigste grunnen til at de eldre centrioles finnes bare 2 eksemplarer per celle og ha tilfeldig orientering, som gjør tolkningen av lokalisering er vanskelig. Derfor ble en protokoll satt opp som tillater forskere å bilde av super-oppløsning et stort antall centrioles, øke sjansen til å observere ikke-tvetydig orientering. Viktigere, som denne metoden er avhengig av bruken av isolerte centrioles, vi gir en metode for å rense intakt C. reinhardtii centrioles som inneholder eldre centrioles og procentrioles.
Til slutt, på grunn av området av centriole retninger som kan avbildes med denne protokollen, enkelt-partikkel analyse kan brukes med elektronmikroskop programvare. Dette resulterer i generasjon av gjennomsnittlig klasser av centrioles i en bestemt retning. Viktigere, kan disse 2D bildene deretter brukes til å vurdere lokaliseringen av et bestemt protein langs centriole. Faktisk denne metoden kan brukes på to-farge super oppløsning, og én farge kan brukes til å vise centriole skjelettet (f.eks, tubulin) mens andre fargen kan tilskrives en bestemt centriolar protein. Ved å trekke gjennomsnitt med én eller to farger, blir det enklere å registrere et protein langs centriole (proksimale, sentral eller distale). Merk at de to kanalene skal justeres nøyaktig for å hindre noen villedende tolkninger. Videre hjelper gjennomsnitt over topp utsikt dechiffrere hvis et protein regionaliserer inne det centriolar lumen, langs microtubule veggen, eller utenfor centriole.
Denne metoden har fordelen å fastslå lokaliseringen av spesifikke proteiner som kan være vanskelig å lokalisere ellers på grunn av heterogene merking. Merk at andre metoder for å tilordne proteiner i centrioles er beskrevet i correlative 3D SIM/SMLM, for eksempel vurdere spesifikk retningene av centrioles ved å bestemme elliptiske profilen på en markør danner en torus rundt den centriole av SIM tenkelig. Bruke denne parameteren, er det mulig å lokalisere protein med en presisjon på 4-5 nm30. Merk også at metoden beskrevet her bruker isolert centrioles med intakt procentrioles, et tegn på at centriole arkitektur er mest sannsynlig i stor grad konservert. Men kan ikke vi utelukke at noen arkitekturdetaljer er forstyrret under rensing, som centriole diameter varierende med konsentrasjonen av divalent kasjoner som forsterket med isolering av menneskelig centrosome5.
En av de viktige trinnene av protokollen presenteres her er å skaffe tilstrekkelig konsentrert isolerte centrioles i forskjellige retninger mottakelig for Fluo-SPA. Gjør først sørge for renhet og effektiviteten av centriole isolasjon prosedyren. En lav konsentrasjon av isolerte centrioles forhindrer riktig bildebehandling og ytterligere bildebehandling. For dette formålet gir vi en metode for å berike antall centrioles per synsfelt. Hvor mange centrioles i fraksjonen brukes, skal volumet i presisjonstørking justeres med største volum 250 µL.
Viktigere, har denne metoden blitt utviklet for en cellevegg minus cw15-C. reinhardtii celler. I denne stammen gir cellen vegg skjørhet en riktig lysis av celler, og dermed frigjøringen av innholdet. Denne protokollen er ikke effektiv for vill-type C. reinhardtii celler, som cellen vegg forhindrer en riktig lysis. Alternative strategier som sonication eller en pre-inkubering av cellene med autolysin, et enzym som kan redusere cellevegg31, må settes på plass å endre cellen vegg før du installerer isolasjon protokollen presenteres her.
Dette oppsettet kan brukes med ulike typer mikroskoper, alt fra konvensjonelle AC confocal mikroskop til høy gjennomstrømning dedikert super-oppløsning mikroskop. Merk at når du gjør SMLM, en spesiell buffer er nødvendig for riktig bildebehandling, og dermed et kammer tilpasset en 12 mm dekkglassvæske med buffer på dekkglassvæske skal brukes. Etterfølgende imaging utføres med invertert mikroskop. Hvis mikroskop oppsett ikke tillater en 12 mm dekkglassvæske, brukes protokollen presenteres her til 18 mm coverslips bruker en 30 mL runde bunn rør og en modifisert adapter og konsentrator. Det er også viktig å Merk at kvaliteten på den endelige rekonstruksjonen i SMLM vil avhenge av kvaliteten på den flekker og den primære antistoff brukes, samt metoden fiksering.
I sammendraget gir vi en metode som kan brukes på bildet mange centrioles etterfulgt av Fluo-SPA som vil generere gjennomsnitt av centrioles i forskjellige retninger, dermed bidra til å lokalisere centriolar protein med presisjon. Viktigere, brukes denne metoden mer generelt til isolerte centrioles fra andre arter, andre, eller store macromolecular samlinger. Endelig utvalg forberedelse tilnærming presenteres her, kombinert med ny algoritme utvikling for single-partikkel analyse av fluorescerende SMLM data32, kan åpne ytterligere forbedring i den molekylære kartografi av store macromolecular samlinger.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Pierre Gönczy og BioImaging & optikk plattform (BIOP) på École Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL), Lausanne, Sveits, hvor SIM bilder av centrioles ble anskaffet. Nikolai Klena og Davide Gambarotto støttes av europeiske Research Council (ERC) starter Grant (StG) 715289 (aksent) og Maeva Le Guennec, Paul Guichard og Virginie Hamel av det sveitsiske National Science Foundation (SNSF) PP00P3_157517. Susanne Borgers er støttet av universitetet i Geneve.
Mouse monoclonal anti-apha tubulin (clone DM1A) | Abcam | ab7291 | dilution 1:300 |
DNaseI | Roche | 10104159001 | |
12 mm coverslips | Roth | YX03.1 | |
18 mm coverslips | Roth | LH23.1 | |
K2HPO4 | Fluka | 60355 | |
KH2PO4 | Fluka | 60230 | |
Tris base | Biosolve Chimie SARL | 0020092391BS | |
acetic acid | Carlo Erba Reagents | 524520 | |
NH4Cl | Sigma | A-4514 | |
CaCl2 | Sigma | C-7902 | |
MgSO4 | Sigma | 63140-500G-F | |
steritop filter | Millipore | SCGPT05RE | |
sucrose | Sigma | S7903-1KG | |
HEPES | AppliChem PanReac | A3724,0250 | |
PIPES | Sigma | P6757-500G | |
MgCl2 | ACROS ORGANICS | 197530010 | |
NP-40 | AppliChem PanReac | A1694,0250 | |
Round-bottom (Kimble) tubes 15 mL | Fisherscientific | 09-500-34 | |
Round-bottom (Kimble) tubes 35 mL | Fisherscientific | 09-500-37 | |
cover glass staining rack | Thomas scientific | 8542E40 | |
crystal polystyrene transmission lab box | FISHERS | 11712944 | |
Methanol | VWR | 20864.32 | |
BSA | Roche | 10735086001 | |
Triton X100 | Roth | 3051.3 | |
goat anti-mouse coupled to Alexa 488 | invitrogen | A11029 | dilution 1:1000 |
goat anti-rabbit coupled to Alexa 568 | invitrogen | A11036 | dilution 1:1000 |
mounting medium | abcam | ab188804 | |
Tube, thinwall polypropylene | Beckman Coulter | 326823 | |
Poly-D-Lysine 1 mg/mL | SIGMA | A-003-E | |
Mouse monoclonal anti-Polyglutamylation modification mAb (GT335) | Adipogen | AG-20B-0020 | dilution 1:1000 |
glycerol mounting medium with DAPI and DABCO | Abcam | ab188804 | |
50 mL conical tubes | Falcon | 14-432-22 | |
Eppendorf 5810R centrifuge | Eppendorf | 5811000622 | |
Beckman JS-13.1 swinging bucket rotor | Beckman Coulter | 346963 | |
Beckman SW 32Ti rotor | Beckman Coulter | 369694 | |
parafilm | Bemis | 13-374-10 | |
Leica TCS SP8 with Hyvolution mode | Leica | ||
OSRAM L18W/954 LUMILUX | Luxe Daylight/ OSRAM | ||
Whatman filter paper | Sigma | WHA1001325 | |
CrSAS-6/Bld12 antibody | dilution 1:300 (Hamel el al, 2014) | ||
Scipion | http://scipion.i2pc.es/ | ||
EM CCD camera (Andor iXON DU897) | Andor |