Détection des virus de bioaérosols à l’aide de résine échangeuse d’anions
Summary
Un anion exchange résines méthode, adaptée au liquide impingement base bioaérosols prélèvement d’échantillons de virus est démontrée. Lorsqu’il est couplé avec la détection moléculaire en aval, la méthode permet une détection facile et sensible des virus de bioaérosols.
Abstract
Ce protocole illustre une méthode d’échantillonnage personnalisées aux bioaérosols de virus. Dans ce système, résine échangeuse d’anions est couplé avec dispositifs d’échantillonnage atmosphérique impingement liquide pour la concentration efficace des virus charge négative de bioaérosols. La résine sert donc, une étape de concentration supplémentaire du flux de travail d’échantillonnage aux bioaérosols. Extraction des acides nucléiques des particules virales est ensuite exécutée directement à partir de la résine échangeuse d’anions, avec l’échantillon qui en résulte adapté aux analyses moléculaires. De plus, ce protocole décrit une chambre aux bioaérosols sur mesure capable de générer des bioaérosols contenant des virus sous une variété de conditions environnementales et permettant une surveillance continue des variables environnementales comme la température, humidité, Vitesse du vent et la concentration massique en aérosol. Le principal avantage de l’utilisation de ce protocole est une sensibilité accrue de détection virale, telle qu’évaluée par comparaison directe avec un impacteur liquide conventionnel non modifié. D’autres avantages incluent la possibilité de concentrer des divers virus charge négative, le faible coût de résine échangeuse d’anions (~$0.14 par exemple) et la facilité d’utilisation. Les inconvénients incluent l’incapacité du présent protocole pour évaluer l’infectivité des particules virales adsorbés à la résine, et éventuellement la nécessité pour l’optimisation de la mémoire tampon de liquide d’échantillonnage utilisées au sein de l’impacteur.
Introduction
Le but de cette méthode est de fournir une plate-forme d’échantillonnage très sensibles aux bioaérosols afin de faciliter la détection moléculaire des virus charge négative de bioaérosols. Micro-organismes, y compris des particules virales, peuvent survivre en bioaérosols pendant de longues périodes de temps1. Bioaérosols peut se déplacer sur des distances relativement longues et maintenir la viabilité et infectiosité, comme en témoigne une épidémie de légionellose qui proviennent de l’industriel situés à une distance de 6 km de personnes touchées de tours de refroidissement et abouti à 18 morts,2. Transmission indirecte du virus aux humains médiées par les bioaérosols peut se produire dans divers milieux et a été démontrée pour les éclosions de norovirus dans les écoles et restaurants3,4. De même, aux bioaérosols transmission du virus peut se produire dans des milieux agricoles telles que dans les élevages de porcs et la volaille, avec cet itinéraire de transmission étant considéré comme un facteur majeur dans la circulation du virus entre les installations de production5, 6 , 7 , 8 , 9.
L’échantillonnage efficace des bioaérosols contenant des virus permet pour l’amélioration des diagnostics rapides et de la protection pour la prévention de l’épidémie, comme indiqué dans les démonstrations dans laquelle H5 grippe A virus ont été détectés de bioaérosols dans l’animal vivant commercialise en Chine et le Aux États-Unis,10,11. Les technologies actuelles de l’échantillonnage aux bioaérosols impliquent un certain nombre de principes de capture des particules différentes et peuvent être classés dans les impacteurs, cyclones, frappe et filtres12. Il n’est pas le champ d’application du présent protocole pour couvrir exhaustivement tous les avantages et les inconvénients de ces plateformes pour prélèvement d’échantillons de virus de bioaérosols ; Cependant, on peut affirmer que la majorité de ces dispositifs d’échantillonnage n’ont pas été optimisée pour la collection de virus et les bactériophages13. En outre, infectiosité des particules virales est souvent négativement affectée, avec des impacteurs liquides censées maintenir l’infectivité virale plus efficacement que l’échantillonnage des périphériques tels que les impacteurs ou filtres solides14. Cependant, un inconvénient de l’impingement liquide est l’effet de dilution de cible, qui se produit parce que les virus sont rassemblés dans des quantités relativement importantes (en général ≥ 20 mL) de liquide dans le récipient de collecte. Un autre inconvénient important implique l’efficacité sous-optimale des impacteurs liquides pour concentrer les particules < 0,5 µM en taille15. Cependant, l’efficacité de ces dispositifs de captage peut être améliorée par immobilisation sur matrices solides, comme l’immobilisation peut améliorer la préservation des acides nucléiques viraux et l’infectivité virale16,17.
Nous avons démontré précédemment que la résine échangeuse d’anions est un outil efficace pour la capture et la concentration de virus à partir de matrices liquides, y compris les bactériophages, virus de l’hépatite A, adénovirus humain et antirotavirus18,19 F-RNA ,,20. Tel que défini par le fabricant, la résine échangeuse d’anions utilisée dans ce travail est une résine d’échangeuse d’anions base solide en polystyrène macroréticulées dans laquelle fonctionnalisées amines quaternaires groupes attraction médiate et capture des anions dans un milieu liquide21 . Par conséquent, la résine échangeuse d’anions devrait capturer les virus avec des charges de surface net négatif, y compris beaucoup de virus entériques, virus de la grippe et autres virus touchant la santé publique et animale.
Le protocole actuel implique l’ajout de résine échangeuse d’anions d’un impacteur liquid. Dans ce système, la résine est une étape de concentration secondaire des particules virales capturé dans le liquide de l’impacteur. Acides nucléiques peut alors être directement éluées par petites quantités, prévoyant un échantillon concentré des analyses moléculaires. Ainsi, le principal avantage de cette méthode est l’amélioration de la sensibilité de détection virale, principalement par le biais de réduction du volume de l’échantillon. En outre, en raison de la capture de non-spécifiques inhérente des virus de charge négative, la méthode est probablement applicable pour la détection d’un grand nombre de virus d’intérêt. Ici, la méthode est démontrée pour les souches vaccinales du virus de l’influenza de type B et de type A et les coliphages FRNA MS2 (MS2). Ces virus sont détectés ultérieurement à l’aide de dosages standard qRT-PCR comme décrit précédemment22. L’utilisateur point final ne devrait pas s’attendre à rencontrer des difficultés dans l’exécution de cette méthode, car les modifications à l’heure actuelle équipement ne constituent pas des perturbations majeures au flux classique de bioaérosols d’échantillonnage et d’analyse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole décrit une méthode pour la capture virale sensible de bioaérosols en utilisant des impacteurs liquides mis à jour le. La méthode est optimisée pour la détection et la quantification de la charge virale dans les bioaérosols. La modification précise démontrée ici implique l’ajout de résine échangeuse d’anions à liquide contenue dans un impacteur liquid commun. Cette méthode a été développée pour sa simplicité dans le traitement de l’échantillon en aval, alors que les autres technique…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été financé par CDC/NIOSH hautes plaines Intermountain Center for Agricultural Health and Safety (5U54OH008085) et le programme de subventions évaluation découverte Bioscience Colorado (14BGF-16).
Materials
| Escherichia coli bacteriophage MS2 (ATCC 15597-B1) | American Type Culture Collection | ATCC 15597-B1 | |
| FluMist Quadrivalent | AstraZeneca | Contact manufacturer | Viral constitutents of this vaccine are subject to change on an annual basis |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855195 | |
| Primers and probes | Integrated DNA Technologies | NA | |
| 0.2 µM sterile filter | NA | NA | |
| 1 L pyrex bottles or equivalent | NA | NA | |
| 1 mL pipet tips | NA | NA | |
| 1 mL pipettor | NA | NA | |
| 50 mL serological pipet | NA | NA | |
| PCR tubes | NA | NA | |
| Pipet-aid or equivalent | NA | NA | |
| QIAamp Viral RNA Mini Kit | Qiagen | 52904 | |
| QuantiTect Probe RT-PCR Kit | Qiagen | 204443 | |
| Amberlite IRA-900 chloride form | Sigma-Aldrich | 216585-500G | |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | |
| Water (molecular biology grade) | Sigma-Aldrich | W4502-1L | |
| Eppendorf DNA LoBind Microcentrifuge Tubes | ThermoFisher | 13-698-791 | |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | ThermoFisher | 14-432-22 | |
| Falcon Polypropylene Centrifuge Tubes | ThermoFisher | 05-538-62 | |
| SuperScript III Platinum One-Step qRT-PCR Kit w/ROX | ThermoFisher | 11745100 | |
| SKC Biosampler 20 mL, 3-piece glass set | SKC Inc. | 225-9593 | |
| Vac-u-Go sample pumps | SKC Inc. | 228-9695 | |
| Collison nebulizer (6-jet) | BGI Inc. | NA | |
| HEPA capsule | PALL | 12144 | |
| Q-TRAK indoor air quality monitor 8554 | TSI Inc. | NA | |
| Alnor velometer thermal anemometer AVM440-A | TSI Inc. | NA | |
| SidePak AM510 personal aerosol monitor | TSI Inc. | NA | |
| Bioaerosol chamber | NA | NA |
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