זיהוי של וירוסים Bioaerosols באמצעות אניון Exchange שרף
Summary
אניון להחליף שיטה מבוססת-שרף, הותאם לנוזל הוכח bioaerosol מבוסס-impingement דגימה של וירוסים. כאשר יחד עם זיהוי מולקולרי במורד הזרם, השיטה מאפשרת גילוי נתיישב ורגיש של וירוסים bioaerosols.
Abstract
פרוטוקול זה מדגים שיטת הדגימה bioaerosol מותאם אישית עבור וירוסים. במערכת זו, אניון exchange שרף הוא ביחד עם התקני הדגימה האוויר מבוסס-impingement נוזלי ריכוז אפקטיבי של אניון וירוסים bioaerosols. לפיכך, השרף מגישה כשלב נוסף ריכוז בזרימת העבודה bioaerosol הדגימה. חומצת גרעין החילוץ של חלקיקי נגיפי ואז מבוצעת ישירות מן השרף exchange אניון, עם הדגימה וכתוצאה מכך מתאים ניתוחים מולקולריים. יתרה מזאת, פרוטוקול זה מתאר תא bioaerosol לפי הזמנה מסוגל לייצר וירוס עמוסי bioaerosols תחת מגוון תנאים סביבתיים, המאפשר ניטור רציף של משתנים סביבתיים כגון טמפרטורה, לחות, מהירות הרוח, ריכוז מסה תרסיס. היתרון העיקרי של שימוש בפרוטוקול זה הוא רגישות מוגברת של איתור נגיפי, כפי העריך באמצעות השוואה ישירה impinger נוזלי קונבנציונאלי שלא שונתה. יתרונות נוספים כוללים את היכולת להתרכז מגוונים-אניון וירוסים, עלות נמוכה של אניון exchange שרף (~$0.14 עבור דגימה), וקלות השימוש. החסרונות כוללים חוסר היכולת של פרוטוקול זה כדי להעריך את infectivity של שרף-הספוחה נגיפים, שעשוי להיות לצורך אופטימיזציה של המאגר דגימה נוזלית שישמש impinger.
Introduction
מטרת שיטה זו היא לספק פלטפורמה דגימה רגישה מאוד bioaerosol כדי להקל על זיהוי מולקולרי של אניון וירוסים bioaerosols. מיקרואורגניזמים, כולל חלקיקים נגיפיים, יכול לשרוד bioaerosols לתקופות ממושכות של זמן1. Bioaerosols ניתן לנסוע על פני מרחקים ארוכים יחסית, לשמור על יכולת הקיום של infectivity, כפי שמעידים על התפרצות מחלת הליגיונרים כי מקורם התעשייה ממוקם במרחק של 6 ק מ אנשים מושפעים במגדלי הקירור ו כתוצאה 18 הרוגים2. שידור ישיר של וירוסים לבני מתווכת על-ידי bioaerosols יכול להתרחש במסגרות מרובות, הוכח עבור norovirus התפרצויות3,של בתי ספר, מסעדות-4. באופן דומה, bioaerosol שידור של וירוסים יכול להתרחש אצל חקלאי הגדרות כגון בחוות חזירים ועופות, עם המסלול לשידור להיחשב כגורם מרכזי בתנועה של וירוסים בין מתקני הייצור5, 6 , 7 , 8 , 9.
הדגימה האפקטיבי של bioaerosols עמוסי וירוס מאפשר שיפור איבחונים ומוכנות למניעת התפרצות, כפי שמוצג בהפגנות ב H5 אילו שפעת וירוסים התגלו מ bioaerosols ב החי משווקת בסין ו ארצות הברית10,11. טכנולוגיות הנוכחי של הדגימה bioaerosol לערב מספר עקרונות ללכוד חלקיקים שונים, ניתן לסווג בהרחבה לתוך impingers, הציקלונים, impactors, מסננים12. . זה מעבר הטווח של פרוטוקול זה לכסות ממצה את כל היתרונות והחסרונות של פלטפורמות אלה עבור דגימה של וירוסים מן bioaerosols; עם זאת, ניתן לקבוע כי הרוב המכריע של התקנים אלה דגימה שלא להיות ממוטבות עבור האוסף של וירוסים ותוכנות bacteriophages13. יתר על כן, infectivity של נגיפים לעיתים קרובות מושפעים לרעה, עם impingers נוזלי נחשב כדי לשמור על infectivity ויראלי בצורה יעילה יותר מאשר דגימה התקנים כגון impactors או מסננים מוצק14. אולם חיסרון אחד של impingement נוזלי הוא האפקט דילול המטרה, אשר מתרחשת מפני וירוסים הם שנאספו בכמויות גדולות יחסית (בדרך כלל ≥ 20 מ”ל) של נוזל בתוך הכלי אוסף. חיסרון חשוב נוסף כרוך יעילות שיוצרת impingers נוזלי להתרכז חלקיקים < 0.5 מיקרומטר גודל15. עם זאת, ניתן לשפר יעילות לכידה של התקנים אלה מאת הנייח על מטריצות מוצק, כפי הנייח יכול לשפר את שימור של חומצות גרעין נגיפיות,16,infectivity ויראלי17.
בעבר הראו כי אניון exchange שרף הוא כלי יעיל עבור לכידת וריכוז של וירוסים של מטריצות נוזלי, לרבות F-RNA bacteriophages, וירוס הפטיטיס A, אדנו אדם בנגיף18,19 ,20. כפי שהוגדרו על ידי היצרן, השרף exchange אניון מנוצל בעבודה זו הוא שרף macroreticular פוליסטירן אניון בסיס חזק exchange האטרקציה התחלקות של קבוצות functionalized אמין רבעוני, לכידתו של אניונים בינוני נוזלי21 . כתוצאה מכך, צפוי השרף exchange אניון ללכוד וירוסים עם חיובים השטח נטו שלילי, לרבות וירוסים המעית רבים, שפעת וירוסים, וירוסים אחרים הנוגעים לבריאות הציבור ובעלי חיים.
בפרוטוקול הנוכחי כולל התוספת של אניון exchange לשרף impinger נוזלי. במערכת זו, משמש השרף צעד ריכוז משניות עבור חלקיקים נגיפיים שנלכדו בתוך הנוזל impinger. חומצות גרעין יכול אז להיות ישירות eluted בכמויות קטנות, מתן דגימת מרוכז עבור ניתוחים מולקולריים. לפיכך, היתרון העיקרי של שיטה זו הוא לשיפור הרגישות לאיתור נגיפי, בעיקר באמצעות צמצום נפח דגימה. בנוסף, בשל התפיסה שאינם ספציפיים הטבועה של וירוסים אניון, השיטה זו סביר ישימה עבור זיהוי של מספר גדול של וירוסים עניין. כאן, השיטה הוא הפגין עבור חיסון זנים של סוג A, וירוסים שפעת מסוג B, את coliphage FRNA MS2 (MS2). וירוסים אלה מאותרים לאחר מכן באמצעות מבחני לרביעיית סטנדרטי-PCR כמו שתואר לעיל22. המשתמש מובילים לא צריך לצפות למפגש קשיים בביצוע שיטה זו, כי השינויים הקיימים כיום ציוד אינם מהווים מרכזי שיבושים לזרימה המקובלת של bioaerosol דיגום וניתוח.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מתאר שיטה עבור לכידת ויראלי רגיש bioaerosols משתמש ששונה impingers נוזלי. השיטה ממוטבת זיהוי, כימות המטען הנגיפי ב- bioaerosols. השינוי מסוימות המודגמות כאן כרוכה התוספת של אניון שרף exchange לנוזל הנכלל של impinger נוזלי נפוצות. שיטה זו פותחה עבור פשטותו בעיבוד מדגם במורד הזרם, ואילו דוגמת עיבוד טכני…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מימון של ה-CDC/NIOSH גבוהה המישורים Intermountain המרכז החקלאי בריאות ובטיחות (5U54OH008085) ואת קולורדו Bioscience גילוי הערכה גרנט התוכנית (14BGF-16).
Materials
| Escherichia coli bacteriophage MS2 (ATCC 15597-B1) | American Type Culture Collection | ATCC 15597-B1 | |
| FluMist Quadrivalent | AstraZeneca | Contact manufacturer | Viral constitutents of this vaccine are subject to change on an annual basis |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855195 | |
| Primers and probes | Integrated DNA Technologies | NA | |
| 0.2 µM sterile filter | NA | NA | |
| 1 L pyrex bottles or equivalent | NA | NA | |
| 1 mL pipet tips | NA | NA | |
| 1 mL pipettor | NA | NA | |
| 50 mL serological pipet | NA | NA | |
| PCR tubes | NA | NA | |
| Pipet-aid or equivalent | NA | NA | |
| QIAamp Viral RNA Mini Kit | Qiagen | 52904 | |
| QuantiTect Probe RT-PCR Kit | Qiagen | 204443 | |
| Amberlite IRA-900 chloride form | Sigma-Aldrich | 216585-500G | |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | |
| Water (molecular biology grade) | Sigma-Aldrich | W4502-1L | |
| Eppendorf DNA LoBind Microcentrifuge Tubes | ThermoFisher | 13-698-791 | |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | ThermoFisher | 14-432-22 | |
| Falcon Polypropylene Centrifuge Tubes | ThermoFisher | 05-538-62 | |
| SuperScript III Platinum One-Step qRT-PCR Kit w/ROX | ThermoFisher | 11745100 | |
| SKC Biosampler 20 mL, 3-piece glass set | SKC Inc. | 225-9593 | |
| Vac-u-Go sample pumps | SKC Inc. | 228-9695 | |
| Collison nebulizer (6-jet) | BGI Inc. | NA | |
| HEPA capsule | PALL | 12144 | |
| Q-TRAK indoor air quality monitor 8554 | TSI Inc. | NA | |
| Alnor velometer thermal anemometer AVM440-A | TSI Inc. | NA | |
| SidePak AM510 personal aerosol monitor | TSI Inc. | NA | |
| Bioaerosol chamber | NA | NA |
References
- Pirtle, E. C., Beran, G. W. Virus survival in the environment. Revue scientifique et technique (International Office of Epizootics). 10 (3), 733-748 (1991).
- Nguyen, T. M., et al. A community-wide outbreak of legionnaires disease linked to industrial cooling towers–how far can contaminated aerosols spread?. The Journal of Infectious Diseases. 193 (1), 102-111 (2006).
- Marks, P. J., et al. Evidence for airborne transmission of Norwalk-like virus (NLV) in a hotel restaurant. Epidemiology and Infection. 124 (3), 481-487 (2000).
- Marks, P. J., et al. A school outbreak of Norwalk-like virus: Evidence for airborne transmission. Epidemiology and Infection. 131 (1), 727-736 (2003).
- Corzo, C. A., Culhane, M., Dee, S., Morrison, R. B., Torremorell, M. Airborne detection and quantification of swine influenza a virus in air samples collected inside, outside and downwind from swine barns. PLoS One. 8 (8), e71444 (2013).
- Anderson, B. D., et al. Bioaerosol sampling in modern agriculture: A novel approach for emerging pathogen surveillance. The Journal of Infectious Diseases. 214 (4), 537-545 (2016).
- Hietala, S. K., Hullinger, P. J., Crossley, B. M., Kinde, H., Ardans, A. A. Environmental air sampling to detect exotic Newcastle disease virus in two California commercial poultry flocks. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 17 (2), 198-200 (2005).
- Jonges, M., et al. Wind-mediated spread of low-pathogenic avian influenza virus into the environment during outbreaks at commercial poultry farms. PLoS One. 10 (5), e0125401 (2015).
- Otake, S., Dee, S. A., Jacobson, L., Torremorell, M., Pijoan, C. Evaluation of aerosol transmission of porcine reproductive and respiratory syndrome virus under controlled field conditions. The Veterinary Record. 150 (26), 804-808 (2002).
- Wu, Y., et al. Aerosolized avian influenza A (H5N6) virus isolated from a live poultry market, China. The Journal of Infection. 74 (1), 89-91 (2017).
- Choi, M. J., et al. Live animal markets in Minnesota: A potential source for emergence of novel influenza A viruses and interspecies transmission. Clinical Infectious Diseases. 61 (9), 1355-1362 (2015).
- Haig, C. W., Mackay, W. G., Walker, J. T., Williams, C. Bioaerosol sampling: Sampling mechanisms, bioefficiency and field studies. The Journal of Hospical Infection. 93 (3), 242-255 (2016).
- Anderson, B. D., Lednicky, J. A., Torremorell, M., Gray, G. C. The use of bioaerosol aampling for airborne virus surveillance in swine production facilities: A mini review. Frontiers in Veterinary Science. 4, 121 (2017).
- Verreault, D., Moineau, S., Duchaine, C. Methods for sampling of airborne viruses. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 72 (3), 413-444 (2008).
- Hogan, C. J. Sampling methodologies and dosage assessment techniques for submicrometre and ultrafine virus aerosol particles. Journal of Applied Microbiology. 99 (6), 1422-1434 (2005).
- Yu, K. -. P., Chen, Y. -. P., Gong, J. -. Y., Chen, Y. -. C., Cheng, C. -. C. Improving the collection efficiency of the liquid impinger for ultrafine particles and viral aerosols by applying granular bed filtration. Journal of Aerosol Science. 101, 133-143 (2016).
- Perez-Mendez, A., et al. Evaluation of a simple and cost effective filter paper-based shipping and storage medium for environmental sampling of F-RNA coliphages. J Virol Methods. 194 (1-2), 60-66 (2013).
- Chandler, J. C., et al. Field-based evaluation of a male-specific (F+) RNA coliphage concentration method. Journal of Virological Methods. 239, 9-16 (2017).
- Perez-Mendez, A., Chandler, J. C., Bisha, B., Goodridge, L. D. Concentration of enteric viruses from tap water using an anion exchange resin-based method. Journal of Virological Methods. 206, 95-98 (2014).
- Perez-Mendez, A., Chandler, J. C., Bisha, B., Goodridge, L. D. Evaluation of an anion exchange resin-based method for concentration of F-RNA coliphages (enteric virus indicators) from water samples. Journal of Virological Methods. 204, 109-115 (2014).
- Kammerer, J., Carle, R., Kammerer, D. R. Adsorption and ion exchange: Basic principles and their application in food processing. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 59 (1), 22-42 (2011).
- Chandler, J. C., et al. A method for the improved detection of aerosolized influenza viruses and the male-specific (F+) RNA coliphage MS2. Journal of Virological Methods. 246, 38-41 (2017).
- Friedman, S. D., Cooper, E. M., Calci, K. R., Genthner, F. J. Design and assessment of a real time reverse transcription-PCR method to genotype single-stranded RNA male-specific coliphages (Family Leviviridae). Journal of Virological Methods. 173 (2), 196-202 (2011).
- Selvaraju, S. B., Selvarangan, R. Evaluation of three influenza A and B real-time reverse transcription-PCR assays and a new 2009 H1N1 assay for detection of influenza viruses. Journal of Clinical Microbiology. 48 (11), 3870-3875 (2010).
- Cademartiri, R., et al. Immobilization of bacteriophages on modified silica particles. Biomaterials. 31 (7), 1904-1910 (2010).
- Michen, B., Graule, T. Isoelectric points of viruses. Journal of Appled Microbiology. 109 (2), 388-397 (2010).
- Turgeon, N., Toulouse, M. J., Martel, B., Moineau, S., Duchaine, C. Comparison of five bacteriophages as models for viral aerosol studies. Applied and Environmental Microbiology. 80 (14), 4242-4250 (2014).
- Vergara, G. G., et al. Evaluation of FRNA coliphages as indicators of human enteric viruses in a tropical urban freshwater catchment. Water Research. 79, 39-47 (2015).
- Tung-Thompson, G., Libera, D. A., Koch, K. L., de Los Reyes, F. L., Jaykus, L. A. Aerosolization of a human norovirus surrogate, bacteriophage MS2, during simulated vomiting. PLoS One. 10 (8), e0134277 (2015).
