Deteksjon av virus fra Bioaerosols bruker Anion Exchange harpiks
Summary
En anion utveksle harpiks-basert metode, tilpasset væske impingement-baserte bioaerosol utvalg av virus er demonstrert. Når kombinert med nedstrøms molekylær deteksjon, gir metoden lettvinte og følsom deteksjon av virus fra bioaerosols.
Abstract
Denne protokollen demonstrerer en tilpasset bioaerosol sampling metoden for virus. I dette systemet kombinert anion exchange harpiks med flytende impingement-baserte luften prøvetaking enheter for effektiv konsentrasjon av negativt ladet virus fra bioaerosols. Dermed fungerer harpiks som et ekstra konsentrasjon skritt i bioaerosol prøvetaking arbeidsflyten. Nukleinsyre utvinning av viral partikler utføres deretter direkte fra anion exchange harpiks, med resulterende prøven egnet for molekylær analyser. Videre, denne protokollen beskriver en spesialbygd bioaerosol kammer generere virusinfisert bioaerosols under ulike miljøforhold og tillater kontinuerlig overvåking av miljøvariabler som temperatur, fuktighet, vindhastighet og aerosol masse konsentrasjon. Den største fordelen med å bruke denne protokollen er økt følsomhet av viral deteksjon, som vurdert via direkte sammenligning til en uendret konvensjonelle flytende impinger. Andre fordeler inkluderer potensial til å satse mangfoldig negativt ladet virus, lavpris anion exchange harpiks (~$0.14 per prøve), og brukervennlighet. Ulemper inkludere manglende evne til denne protokollen å vurdere infectivity av harpiks-adsorbert virus partikler, og potensielt behov for optimalisering av flytende prøvetaking bufferen brukes innenfor impinger.
Introduction
Formålet med denne metoden er å gi en svært følsom bioaerosol prøvetaking plattform for å lette molekylær deteksjon av negativt ladet virus fra bioaerosols. Mikroorganismer, inkludert virus partikler, kan overleve i bioaerosols over lengre tid1. Bioaerosols kan reise over relativt lange distanser og opprettholde levedyktighet og infectivity, noe som gjenspeiles av et utbrudd av Legionærsyken ‘ som stammer fra industrielle kjøletårn ligger i en avstand på 6 km fra de berørte personene og resulterte i 18 dødsfall2. Indirekte overføring av virus til mennesker formidlet av bioaerosols kan forekomme i flere innstillinger, og er blitt demonstrert for norovirus utbrudd i skoler og restauranter3,4. Tilsvarende kan bioaerosol overføring av virus oppstå i landbruket innstillinger som i svin og fjørfe gårder, med denne overføring ruten blir vurdert som en viktig faktor i bevegelsen av virus mellom produksjon fasiliteter5, 6 , 7 , 8 , 9.
Effektiv utvalg av virusinfisert bioaerosols gir bedring i rask diagnostikk og beredskap for utbruddet forebygging, som vist i demonstrasjoner i hvilke H5 influensa en virus ble oppdaget fra bioaerosols i levende dyr markeder i Kina og USA10,11. Dagens bioaerosol prøvetaking teknologi innebærer en rekke ulike partikkelstørrelse fange prinsipper, og kan grovt deles inn i impingers, sykloner, impactors og filtre12. Det er utenfor omfanget av denne protokollen til å grundig dekke alle fordelene og ulempene ved disse plattformene for prøvetaking av virus fra bioaerosols; Imidlertid kan man konstatere at fleste av disse prøvetaking enhetene ikke er optimalisert for innsamling av virus og bacteriophages13. Videre er infectivity virus partikler ofte påvirket negativt, med flytende impingers vurdert å opprettholde viral infectivity mer effektivt enn prøvetaking enheter som solid impactors eller filtre14. En ulempe med flytende impingement er imidlertid målet fortynning effekt, som oppstår fordi virus er samlet i relativt store mengder (vanligvis ≥20 mL) av væske i samling fartøyet. En annen viktig ulempe innebærer suboptimal effektiviteten av flytende impingers å konsentrere partikler < 0,5 µM i størrelse15. Imidlertid kan fange effektiviteten av disse enhetene forbedres ved immobilisering på solid matriser, som immobilisering kan forbedre viral nukleinsyrer og viral infectivity16,17.
Vi har tidligere vist at anion exchange harpiks er et effektivt verktøy for fangst og konsentrasjonen av virus fra flytende matriser, inkludert F-RNA bacteriophages, hepatitt b-viruset, human adenovirus og rotavirus18,19 ,20. Som definert av produsenten, er anion exchange harpiks benyttet i dette arbeidet en macroreticular polystyren sterk base anion exchange harpiks functionalized kvartær Amin grupper megle attraksjon og erobringen av anioner i flytende medium21 . Følgelig forventes anion exchange harpiks å fange virus med net-negativ overflaten kostnader, inkludert mange enteric virus, influensavirus og andre virus som er relevant for offentligheten og dyr sunnhet.
Gjeldende protokollen omfatter tillegg av anion exchange harpiks til en flytende impinger. I dette systemet fungerer harpiks som en sekundær konsentrasjon skritt for virus partikler fanget i impinger væsken. Nukleinsyrer kan deretter direkte elut i små volumer, gir en konsentrert utvalg for molekylær analyser. Dermed er den største fordelen med denne metoden forbedringen i virus oppdagelsen følsomhet, primært gjennom reduksjon i eksempel volum. I tillegg, på grunn av iboende uspesifisert erobringen av negativt ladet virus, metoden er trolig gjelder for deteksjon av mange virus av interesse. Her er metoden demonstrert for vaksine stammer av en type B influensavirus og FRNA coliphage MS2 (MS2). Disse virusene oppdages senere ved hjelp av standard qRT PCR analyser som beskrevet tidligere22. End-point brukeren bør ikke forvente å møte vanskeligheter med å utføre denne metoden fordi endringer er eksisterende utstyr ikke utgjør store forstyrrelser konvensjonelle flyten av bioaerosol prøvetaking og analyse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokollen definerer en metode for følsom viral fangst fra bioaerosols bruker endret flytende impingers. Metoden er optimalisert for deteksjon og kvantifisering av viral belastning i bioaerosols. Bestemte modifikasjonen demonstrert her omfatter tillegg av anion exchange harpiks til væske i en felles flytende impinger. Denne metoden ble utviklet for sin enkelhet i nedstrøms prøve behandling, mens andre prøve behandling teknikker som sentrifugering, filtrering og nedbør-baserte metoder ikke tilbyr slike en for…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av finansiering fra CDC/NIOSH høye slettene Intermountain senter for landbruket helse og sikkerhet (5U54OH008085) og Colorado Bioscience Discovery evaluering Grant Program (14BGF-16).
Materials
| Escherichia coli bacteriophage MS2 (ATCC 15597-B1) | American Type Culture Collection | ATCC 15597-B1 | |
| FluMist Quadrivalent | AstraZeneca | Contact manufacturer | Viral constitutents of this vaccine are subject to change on an annual basis |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855195 | |
| Primers and probes | Integrated DNA Technologies | NA | |
| 0.2 µM sterile filter | NA | NA | |
| 1 L pyrex bottles or equivalent | NA | NA | |
| 1 mL pipet tips | NA | NA | |
| 1 mL pipettor | NA | NA | |
| 50 mL serological pipet | NA | NA | |
| PCR tubes | NA | NA | |
| Pipet-aid or equivalent | NA | NA | |
| QIAamp Viral RNA Mini Kit | Qiagen | 52904 | |
| QuantiTect Probe RT-PCR Kit | Qiagen | 204443 | |
| Amberlite IRA-900 chloride form | Sigma-Aldrich | 216585-500G | |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | |
| Water (molecular biology grade) | Sigma-Aldrich | W4502-1L | |
| Eppendorf DNA LoBind Microcentrifuge Tubes | ThermoFisher | 13-698-791 | |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | ThermoFisher | 14-432-22 | |
| Falcon Polypropylene Centrifuge Tubes | ThermoFisher | 05-538-62 | |
| SuperScript III Platinum One-Step qRT-PCR Kit w/ROX | ThermoFisher | 11745100 | |
| SKC Biosampler 20 mL, 3-piece glass set | SKC Inc. | 225-9593 | |
| Vac-u-Go sample pumps | SKC Inc. | 228-9695 | |
| Collison nebulizer (6-jet) | BGI Inc. | NA | |
| HEPA capsule | PALL | 12144 | |
| Q-TRAK indoor air quality monitor 8554 | TSI Inc. | NA | |
| Alnor velometer thermal anemometer AVM440-A | TSI Inc. | NA | |
| SidePak AM510 personal aerosol monitor | TSI Inc. | NA | |
| Bioaerosol chamber | NA | NA |
References
- Pirtle, E. C., Beran, G. W. Virus survival in the environment. Revue scientifique et technique (International Office of Epizootics). 10 (3), 733-748 (1991).
- Nguyen, T. M., et al. A community-wide outbreak of legionnaires disease linked to industrial cooling towers–how far can contaminated aerosols spread?. The Journal of Infectious Diseases. 193 (1), 102-111 (2006).
- Marks, P. J., et al. Evidence for airborne transmission of Norwalk-like virus (NLV) in a hotel restaurant. Epidemiology and Infection. 124 (3), 481-487 (2000).
- Marks, P. J., et al. A school outbreak of Norwalk-like virus: Evidence for airborne transmission. Epidemiology and Infection. 131 (1), 727-736 (2003).
- Corzo, C. A., Culhane, M., Dee, S., Morrison, R. B., Torremorell, M. Airborne detection and quantification of swine influenza a virus in air samples collected inside, outside and downwind from swine barns. PLoS One. 8 (8), e71444 (2013).
- Anderson, B. D., et al. Bioaerosol sampling in modern agriculture: A novel approach for emerging pathogen surveillance. The Journal of Infectious Diseases. 214 (4), 537-545 (2016).
- Hietala, S. K., Hullinger, P. J., Crossley, B. M., Kinde, H., Ardans, A. A. Environmental air sampling to detect exotic Newcastle disease virus in two California commercial poultry flocks. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 17 (2), 198-200 (2005).
- Jonges, M., et al. Wind-mediated spread of low-pathogenic avian influenza virus into the environment during outbreaks at commercial poultry farms. PLoS One. 10 (5), e0125401 (2015).
- Otake, S., Dee, S. A., Jacobson, L., Torremorell, M., Pijoan, C. Evaluation of aerosol transmission of porcine reproductive and respiratory syndrome virus under controlled field conditions. The Veterinary Record. 150 (26), 804-808 (2002).
- Wu, Y., et al. Aerosolized avian influenza A (H5N6) virus isolated from a live poultry market, China. The Journal of Infection. 74 (1), 89-91 (2017).
- Choi, M. J., et al. Live animal markets in Minnesota: A potential source for emergence of novel influenza A viruses and interspecies transmission. Clinical Infectious Diseases. 61 (9), 1355-1362 (2015).
- Haig, C. W., Mackay, W. G., Walker, J. T., Williams, C. Bioaerosol sampling: Sampling mechanisms, bioefficiency and field studies. The Journal of Hospical Infection. 93 (3), 242-255 (2016).
- Anderson, B. D., Lednicky, J. A., Torremorell, M., Gray, G. C. The use of bioaerosol aampling for airborne virus surveillance in swine production facilities: A mini review. Frontiers in Veterinary Science. 4, 121 (2017).
- Verreault, D., Moineau, S., Duchaine, C. Methods for sampling of airborne viruses. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 72 (3), 413-444 (2008).
- Hogan, C. J. Sampling methodologies and dosage assessment techniques for submicrometre and ultrafine virus aerosol particles. Journal of Applied Microbiology. 99 (6), 1422-1434 (2005).
- Yu, K. -. P., Chen, Y. -. P., Gong, J. -. Y., Chen, Y. -. C., Cheng, C. -. C. Improving the collection efficiency of the liquid impinger for ultrafine particles and viral aerosols by applying granular bed filtration. Journal of Aerosol Science. 101, 133-143 (2016).
- Perez-Mendez, A., et al. Evaluation of a simple and cost effective filter paper-based shipping and storage medium for environmental sampling of F-RNA coliphages. J Virol Methods. 194 (1-2), 60-66 (2013).
- Chandler, J. C., et al. Field-based evaluation of a male-specific (F+) RNA coliphage concentration method. Journal of Virological Methods. 239, 9-16 (2017).
- Perez-Mendez, A., Chandler, J. C., Bisha, B., Goodridge, L. D. Concentration of enteric viruses from tap water using an anion exchange resin-based method. Journal of Virological Methods. 206, 95-98 (2014).
- Perez-Mendez, A., Chandler, J. C., Bisha, B., Goodridge, L. D. Evaluation of an anion exchange resin-based method for concentration of F-RNA coliphages (enteric virus indicators) from water samples. Journal of Virological Methods. 204, 109-115 (2014).
- Kammerer, J., Carle, R., Kammerer, D. R. Adsorption and ion exchange: Basic principles and their application in food processing. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 59 (1), 22-42 (2011).
- Chandler, J. C., et al. A method for the improved detection of aerosolized influenza viruses and the male-specific (F+) RNA coliphage MS2. Journal of Virological Methods. 246, 38-41 (2017).
- Friedman, S. D., Cooper, E. M., Calci, K. R., Genthner, F. J. Design and assessment of a real time reverse transcription-PCR method to genotype single-stranded RNA male-specific coliphages (Family Leviviridae). Journal of Virological Methods. 173 (2), 196-202 (2011).
- Selvaraju, S. B., Selvarangan, R. Evaluation of three influenza A and B real-time reverse transcription-PCR assays and a new 2009 H1N1 assay for detection of influenza viruses. Journal of Clinical Microbiology. 48 (11), 3870-3875 (2010).
- Cademartiri, R., et al. Immobilization of bacteriophages on modified silica particles. Biomaterials. 31 (7), 1904-1910 (2010).
- Michen, B., Graule, T. Isoelectric points of viruses. Journal of Appled Microbiology. 109 (2), 388-397 (2010).
- Turgeon, N., Toulouse, M. J., Martel, B., Moineau, S., Duchaine, C. Comparison of five bacteriophages as models for viral aerosol studies. Applied and Environmental Microbiology. 80 (14), 4242-4250 (2014).
- Vergara, G. G., et al. Evaluation of FRNA coliphages as indicators of human enteric viruses in a tropical urban freshwater catchment. Water Research. 79, 39-47 (2015).
- Tung-Thompson, G., Libera, D. A., Koch, K. L., de Los Reyes, F. L., Jaykus, L. A. Aerosolization of a human norovirus surrogate, bacteriophage MS2, during simulated vomiting. PLoS One. 10 (8), e0134277 (2015).
