Detección de virus de bioaerosoles utilizando resina de intercambio aniónico
Summary
Un anión intercambio método basado en la resina, adaptado para muestreo de bioaerosol basado en el choque de los virus se demuestra el líquido. Cuando se combina con detección molecular aguas abajo, el método permite la detección fácil y sensible de virus de bioaerosoles.
Abstract
Este protocolo muestra un método de muestreo de bioaerosol modificado para requisitos particulares en busca de virus. En este sistema, resina de intercambio aniónico es junto con dispositivos de muestreo de aire líquido basado en el choque para la concentración eficaz de virus cargado negativamente de bioaerosoles. Así, la resina sirve como un paso adicional de la concentración del flujo de trabajo de muestreo de bioaerosol. Extracción de ácidos nucleicos de las partículas virales se realiza directamente en la resina de intercambio aniónico, con la muestra que resulta adecuada para los análisis moleculares. Además, este protocolo describe una cámara de un bioaerosol capaz de generar bioaerosoles cargados de virus en una variedad de condiciones ambientales y que permite el monitoreo continuo de variables ambientales como temperatura, humedad, velocidad del viento y concentración masiva de aerosoles. La principal ventaja de utilizar este protocolo es el aumento de la sensibilidad de la detección viral, evaluada mediante comparación directa con un impactor de líquido convencional sin modificar. Otras ventajas incluyen el potencial de concentrar diversos virus cargado negativamente, el bajo costo de la resina de intercambio aniónico (~$0.14 por ejemplo) y la facilidad de uso. Desventajas incluyen la incapacidad de este protocolo para evaluar la infectividad de resina adsorbe las partículas virales, y potencialmente la necesidad de la optimización de la solución de muestreo líquido utilizado en el impactor.
Introduction
El propósito de este método es proporcionar una plataforma de muestreo de bioaerosol altamente sensible para facilitar la detección molecular de virus cargado negativamente de bioaerosoles. Microorganismos, incluyendo partículas virales, pueden sobrevivir en bioaerosoles durante largos períodos de tiempo1. Bioaerosoles pueden viajar distancias relativamente largas y mantener la viabilidad e infectividad, evidenciada por un brote de legionelosis que se originó de Torres ubicados a una distancia de 6 km de los individuos afectados de refrigeración industrial y dio lugar a 18 fatalidades2. Transmisión indirecta del virus a los seres humanos mediados por bioaerosoles puede ocurrir en múltiples escenarios y se ha demostrado para brotes de norovirus en escuelas y restaurantes3,4. Del mismo modo, bioaerosol transmisión del virus puede ocurrir en ambientes agrícolas como en las granjas de cerdos y aves de corral, con esta ruta de transmisión se considera como un factor importante en el movimiento del virus entre producción instalaciones5, 6 , 7 , 8 , 9.
Efectivo muestreo de bioaerosoles cargados de virus permite la mejora en el diagnóstico rápido y la preparación para la prevención del brote, como se muestra en las manifestaciones en que H5 de bioaerosoles en el animal vivo se detectaron un virus de la influenza los mercados en China y la Estados Unidos10,11. Tecnologías de muestreo de bioaerosol actuales implican a una serie de principios de captura de partículas diferentes y se pueden categorizar ampliamente en impingers, impactadores, ciclones y filtros12. Está más allá del alcance de este protocolo para cubrir exhaustivamente todas las ventajas y desventajas de estas plataformas para muestreo de virus de bioaerosoles; sin embargo, se puede afirmar que la mayoría de estos dispositivos de muestreo no ha sido optimizada para la colección de virus y bacteriófagos13. Además, infectividad de las partículas virales se afectados a menudo negativamente, con impingers líquidos considerados mantener infectividad viral más eficazmente que muestras como impactadores o filtros sólidos14. Sin embargo, una desventaja de choque líquida es el efecto de dilución del blanco, que ocurre porque el virus se recogen en volúmenes relativamente grandes (normalmente ≥ 20 mL) de líquido en el recipiente de colección. Otra desventaja importante implica la eficacia subóptima de impingers líquidos a concentrar partículas < 0,5 μm de tamaño15. Sin embargo, la eficiencia de captura de estos dispositivos puede mejorarse mediante inmovilización en matrices sólidas, como inmovilización puede mejorar la preservación de los ácidos nucleicos virales y de infectividad viral16,17.
Previamente hemos demostrado que la resina del intercambio de aniones es una herramienta eficaz para la captación y concentración de virus en matrices líquidas, incluyendo F-RNA bacteriófagos, virus de la hepatitis A, adenovirus humano y rotavirus18,19 ,20. Según lo definido por el fabricante, la resina de intercambio aniónico utilizada en este trabajo es una resina de intercambio de anión base fuerte poliestireno macroreticular en que amina cuaternario funcionalizados grupos medie atracción y captura de aniones en un medio líquido21 . En consecuencia, la resina de intercambio aniónico se espera capturar virus con cargas superficiales neto negativo, incluyendo muchos de los virus entéricos, virus de la influenza y otros virus relevantes para la salud pública y animal.
El protocolo actual consiste en la adición de resina de intercambio aniónico para un líquido impinger. En este sistema, la resina sirve como paso secundario de la concentración de partículas virales en el líquido impinger. Los ácidos nucleicos pueden ser eluidos directamente en volúmenes pequeños, proporcionando una muestra concentrada para análisis moleculares. Así, la principal ventaja de este método es la mejora en sensibilidad de detección viral, principalmente a través de la reducción en el volumen de la muestra. Además, debido a la inherente captura no específicos de virus cargado negativamente, el método es probable aplicable para la detección de un gran número de virus de interés. Aquí, el método se demuestra cepas vacunales de virus de la influenza tipo B, tipo A y el FRNA colifago MS2 (MS2). Estos virus son detectados posteriormente usando análisis de qRT-PCR estándar como se describió anteriormente22. El usuario final no debe esperar dificultades en la realización de este método, debido a modificaciones existentes en la actualidad equipos no constituyen importantes interrupciones en el flujo convencional de bioaerosol muestreo y análisis.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo describe un método para la captura de viral sensible de bioaerosoles utilizando impingers líquidos modificados. El método se ha optimizado para la detección y cuantificación de la carga viral en bioaerosoles. La modificación específica demostrada aquí consiste en la adición de resina de intercambio aniónico líquido contenida en un impinger líquido común. Este método fue desarrollado por su sencillez en el procesamiento de las muestras aguas abajo, mientras que otras técnicas de procesamiento…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por fondos de la CDC/NIOSH alta llanura Intermountain centro de Sanidad Agropecuaria e inocuidad (5U54OH008085) y el Colorado Bioscience descubrimiento evaluación programa (14BGF-16).
Materials
| Escherichia coli bacteriophage MS2 (ATCC 15597-B1) | American Type Culture Collection | ATCC 15597-B1 | |
| FluMist Quadrivalent | AstraZeneca | Contact manufacturer | Viral constitutents of this vaccine are subject to change on an annual basis |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855195 | |
| Primers and probes | Integrated DNA Technologies | NA | |
| 0.2 µM sterile filter | NA | NA | |
| 1 L pyrex bottles or equivalent | NA | NA | |
| 1 mL pipet tips | NA | NA | |
| 1 mL pipettor | NA | NA | |
| 50 mL serological pipet | NA | NA | |
| PCR tubes | NA | NA | |
| Pipet-aid or equivalent | NA | NA | |
| QIAamp Viral RNA Mini Kit | Qiagen | 52904 | |
| QuantiTect Probe RT-PCR Kit | Qiagen | 204443 | |
| Amberlite IRA-900 chloride form | Sigma-Aldrich | 216585-500G | |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | |
| Water (molecular biology grade) | Sigma-Aldrich | W4502-1L | |
| Eppendorf DNA LoBind Microcentrifuge Tubes | ThermoFisher | 13-698-791 | |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | ThermoFisher | 14-432-22 | |
| Falcon Polypropylene Centrifuge Tubes | ThermoFisher | 05-538-62 | |
| SuperScript III Platinum One-Step qRT-PCR Kit w/ROX | ThermoFisher | 11745100 | |
| SKC Biosampler 20 mL, 3-piece glass set | SKC Inc. | 225-9593 | |
| Vac-u-Go sample pumps | SKC Inc. | 228-9695 | |
| Collison nebulizer (6-jet) | BGI Inc. | NA | |
| HEPA capsule | PALL | 12144 | |
| Q-TRAK indoor air quality monitor 8554 | TSI Inc. | NA | |
| Alnor velometer thermal anemometer AVM440-A | TSI Inc. | NA | |
| SidePak AM510 personal aerosol monitor | TSI Inc. | NA | |
| Bioaerosol chamber | NA | NA |
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