Isolering och identifiering av extravaskulära immunceller i hjärtat

Summary

Detta protokoll presenterar en enkel och effektiv metod för att isolera, identifiera och kvantifiera immunceller som är bosatta i myokardiet möss under steady-state eller inflammation. Protokollet kombinerar enzymatisk och mekanisk matsmältningen för generering av en enda cellsuspension som ytterligare kan analyseras med flödescytometri.

Abstract

Immunförsvaret är en viktig komponent i ett friskt hjärta. Hjärtmuskeln är hem för en rik population av olika immunceller undergrupper med funktionell uppdelning under steady-state och olika former av inflammation. Tills nyligen, studiet av immunceller i hjärtat krävs användning av mikroskopi eller dåligt utvecklad matsmältning-protokollen, som tillhandahålls tillräckligt känslighet under svår inflammation men kunde inte tryggt identifiera små — men nyckel — populationer av celler under steady-state. Här diskuterar vi en enkel metod kombinerar enzymatisk (kollagenas, hyaluronidas och DNAse) och mekanisk nedbrytning av murina hjärtan föregås av Intravaskulär administrering av fluorescently-märkta antikroppar att skilja liten men oundvikliga intravaskulära cell föroreningar. Metoden genererar en suspension av isolerade viabla celler som kan analyseras med flödescytometri för identifiering, fenotypning och kvantifiering, eller ytterligare renas med fluorescens-aktiverad cell sortering eller magnetiska pärla separation för transkriptionell analys eller in vitro- studier. Vi har ett exempel på en stegvisa flöde flödescytometrisk analys att skilja de viktiga makrofager och dendritiska cellpopulationer av hjärtat. För en medellång medelstora experiment (10 hjärtan) kräver avslutningen av förfarandet 2 – 3 h.

Introduction

Olika former av hjärtinfarkt stress eller skada, inklusive ischemisk (ischemi reperfusion eller hjärtinfarkt) och icke-ischemisk (hypertoni eller myokardit), främja rekrytering av inflammatoriska celler med reparerande och skyddande, men också patogena egenskaper. Så tidigt som 1891, beskrev Romberg först förekomsten av cellulära infiltrat i myokardiet patienter smittade med tyfus och scharlakansfeber¹. Den detaljerade studien av hjärt immunceller krävs dock utvecklingen av mer avancerade immunophenotyping tekniker. Följaktligen, har nyligen vi börjat förstå att en mångskiftande befolkningen av immunceller med nödvändigt underhållsarbete roller under steady-state är bosatt inom myokardiet.

Histologi har varit, och fortfarande är den vanligaste metoden att karakterisera hjärt immunceller vid inflammation. Men medan histologi representerar ett värdefullt diagnostiskt verktyg, har dess användning i studien av hjärt immunceller viktiga begränsningar. Immuncellerna bosatta i myokardiet utgör en mycket liten andel av de totala cellerna och är mer eller mindre jämnt fördelade i ett proportionellt enorma utrymme. Likaså visar flera former av hjärt inflammation, till exempel viral myokardit, focal mönster av inflammation. Detta innebär att korrekt analys av immunsystemet hos hjärtat ofta kräver högre grader av histologisk provtagning, ökar kostnaden för att minska bias. Dessutom ger histologi en mycket begränsad mängd användbara informationen i cell identifiering (t.ex. antal parametrar). Med ett ständigt ökande antal cell delmängder som kräver användning av flera uttryck markörer (inklusive yta markörer, transkriptionsfaktorer eller utsöndras molekyler), har flödescytometri etablerat sig som det mest kraftfulla verktyget för immunophenotyping, på grund av låga kostnader och hög genomströmning.

Användningen av immunophenotyping metoder är nära beroende av utvecklingen av effektiv matsmältning protokoll som tillåts för singel-celler analys av stort antal celler. Utvecklingen av uttömmande protokoll av cell utvinning öppnas ett nytt fönster av möjligheter i studien av hjärt immunologi. Genom kombinationen av matsmältningen, flödescytometri och transkriptomik varit de stora populationerna av makrofager och dendritiska celler som bor i hjärtat kännetecknas^2,3. Den vanligast förekommande befolkningen av hjärt immunceller under steady-state är CD64⁺MerTK⁺ makrofager, som kan delas upp ytterligare baserat på deras uttryck för CCR2 eller CD11c². CCR2⁺ makrofager kommer från vuxen benmärg blodbildning, medan majoriteten av CCR2^– makrofager, som kan uttrycka höga eller låga nivåer av MHC-II, är främst av prenatal ursprung. Makrofager utför viktiga funktioner såsom reparation⁴ och avlägsnande av skräp⁵ under skada eller stödja elektrisk anslutning⁶ i steady state. Under olika former av inflammation en viktig tillströmning av Ly6C^Hej MHC-II^lo CD64^int monocyter uppstå, som senare differentieras till Ly6C^Hej CCR2⁺ makrofager^2,7 . En betydligt mindre, men viktiga, population av celler som är bosatta i hjärtmuskeln hos friska individer består av dendritiska celler^8,9. Två stora delmängder av hjärt konventionella DCs (CDC) har karaktäriserats nyligen: cDC1 (CD103⁺ DCs) och cDC2 (CD11b⁺ DCs). DCs spelar viktiga roller i försvar mot infektion⁸ men kan också främja självskadebeteende vid inflammation, särskilt under hjärtinfarkt⁹.

Här, beskriver vi en enkel metod för isolering av livskraftiga hjärt immunceller från mus myokardiet. Metoden kombinerar enzymatisk och mekanisk matsmältningen med en cell-SIL filtrering för att erhålla en enda cellsuspension som kan analyseras eller ytterligare renas, av flöde flödescytometri sortering eller magnetiska pärla anrikning. Noggranna mätningar av extravaskulära hjärtmuskelceller kräver hjärt perfusion för att ta bort eventuella föroreningar från blodet av den kardiella mikrocirkulation. Dessutom presenterar vi ett valfritt steg av intravaskulär märkning av immunceller som kan användas för att ytterligare differentiera hjärtmuskelceller från intravaskulär föroreningar, baserat på Galkina et al. protokoll¹⁰. Slutligen presenterar vi en grundläggande flöde flödescytometri analys för att identifiera stora makrofag och cDC subpopulationsna.

Protocol

Etik uttalande: detta protokoll har granskats och godkänts av Animal Care kommitté vid the University Health Network (Toronto, Kanada) och uppfyller kraven i kanadensiska rådet om djur vård. 1. buffert förberedelse Förbereda HBB buffert (Hank’s Balanced Salt lösning (HBSS), 2% värme inaktiverat bovint serum, 0,2% bovint serumalbumin). Tillsätt 10 mL av värme inaktiverat bovint serum och 1 g av bovint serum albumin till 500 mL HBSS. Filter sterilisera genom ett 0,2 µm filte…

Representative Results

Hittills har har ingen bra metod utformats för att isolera immunceller från andra kardiella cell komponenter, såsom hjärtmuskelcellerna. Analysen av hjärt enda cellsuspension av flödescytometri kräver därför en pre gating med CD45 att identifiera immunceller befolkningarna, följt av enskild cell och liten storlek utslagning Usenets (figur 1A). En livskraft färgning kan alternativt utföras för att utesluta döda celler. Liten stor…

Discussion

Hjärtinfarkt, inflammation eller myokardit, är en funktion av den kardiovaskulära sjukdomar. Hjärtmuskeln är dock inte saknar egen immuna komponenter i icke-sjukdomstillstånd. Under steady-state många immunceller bosatta i hjärtmuskeln och spela viktiga roller underhåll och skydd. Karakterisering av dessa olika populationer av celler skulle inte ha varit möjligt utan metoder såsom den presenteras i detta protokoll.

En kombination av mekaniska och enzymatisk nedbrytning av myokardiet…

Materials

Phosphate buffered saline	Wisent	311-010-CL	1x PBS
21Gx 1 1/2 (0.8mmx40mm) PrecisionGlide Needle	BD	305167
Hank’s Balanced Salt Solution	Wisent	311-511-CL	1x HBSS
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A4503-50G
Bovine serum	Sigma	B9433
0.5M Ethylenediaminetetraacetic acid	BioShop	EDT111
Vacuum filter , 0.2 µm Filtropur V50	Sarstedt	83.1823.001
28G 1/2 1 cc insulin syringe	BD	329424
60 mL syringe	BD	309653
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Wisent	319-005-CL	1x DMEM with 4.5 g/L glucose and L-Glutamine and Sodium Pyruvate
Collagenase I	Sigma	C0130	from Clostridium histolyticum
Hyaluronidase type I-S	Sigma	H3506
DNase-I	Sigma	D4513	from bovine pancreas
Cell strainer, 40 µm Nylon	Falcon	352340
Ammonium-Chloride- Potassium (ACK) lysis buffer	Lonza	10-546E
Alexa Fluor 700 anti-mouse/human CD11b	Biolegend	101222	1:250 dilution
APC/Cy7 anti-mouse Ly-6c	Biolegend	128025	1:250 dilution
APC anti-mouse CD103	Biolegend	121414	1:250 dilution
Brilliant Violet 605 anti-mouse CD11c	Biolegend	117334	1:250 dilution
PE anti-mouse Ly-6G	Biolegend	127607	1:250 dilution
Pacific Blue anti-mouse I-Ab	Biolegend	116422	1:250 dilution
FITC anti-mouse CD64 (FcgRI)	Biolegend	139315	1:250 dilution
PE/Cy7 anti-mouse CD45	Biolegend	103113	1:250 dilution
PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD45	Biolegend	103132	1:40 dilution
TruStain fcX (anti-mouse CD16/32)	Biolegend	101320	1:100 dilution
True-Stain Monocyte Blocker	Biolegend	426101	1:20 dilution
FlowJo V10	TreeStar Inc		https://www.flowjo.com/solutions/flowjo
Mouse: Batf3-/-	The Jackson Laboratory	JAX: 013755