방법 논문

만능 줄기 세포 유래 Teratomas 외부 빔 방사선을 사용 하 여 작은 동물 모델에서의 타겟 및 선택적 치료

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DOI:

10.3791/58115

2019년 2월 17일

이 논문에서

요약

만능 줄기 세포 유래 teratomas 위한 치료 전략에 대 한 연구는 줄기 세포 치료의 임상 번역 중요 합니다. 여기, 우리 첫째, 쥐에서 그리고, 선택적으로 대상 줄기 세포 유래 teratomas를 생성 하 고 생체 조건 작은 동물 irradiator를 사용 하 여 이러한 종양을 치료 하는 프로토콜을 설명 합니다.

초록

"줄기 세포 관광," 전세계 줄기 세포의 관계가 없는 이식의 피해자의 증가 줄기 세포 이식의 안전에 대 한 우려를 제기 했다. Teratomas 아직도 이식 시 잔여 미 분화 줄기 세포의 존재에서 발생할 수 있습니다 또는에 자발적인 돌연변이에서 분화의 이식 분화 보다는 미 분화 세포는 일반적인 관행, 비록 셀입니다. 줄기 세포 치료는 종종 해부학 민감한 사이트에 전달 됩니다, 때문에 작은 종양 임상, 실명, 마비, 인지 이상, 그리고 심장 혈관 장애의 결과로 파괴 될 수 있습니다. 이 사이트에 대 한 외과 액세스 제한, 몇 가지 치료 옵션과 함께 환자를 떠나 있을 수 있습니다. 줄기 세포 비행 제어는, 따라서, 줄기 세포 치료의 임상 번역에 대 한 중요 한입니다.

외부 빔 방사선 장기 주변에 부상을 최소화 하면서 기형종 부담을 줄이려면 타겟된 치료 제공의 효과적인 수단을 제공 합니다. 또한,이 방법은 유전자 조작 방지 또는 줄기 세포는 바이러스 성 변환 추가 임상 안전성 및 효능 우려와 관련 된. 여기, 우리는 쥐에 있는 pluripotent 줄기 세포 유래 teratomas를 만들려고 하 고 선택적으로 이러한 종양 vivo에서 ablate을 외부 빔 방사선 치료를 적용 하는 프로토콜을 설명 합니다.

서론

조직 재생을 위한 줄기 세포 치료의 개발이 발생 했습니다 장벽 수를 지난 몇 십년에 효율적인 임상 배포에 대 한 노력을 방해. 이러한 장애물에 전달, 줄기 세포 immunogenicity 및 양식 teratomas1종양 약 잠재력의 사이트에서 가난한 셀 보존을 포함 됩니다. Tumorigenicity은 특정 임상 관심사의 줄기 세포 이식 받는 사람2를 손상 시킬 수 있습니다. 종양의 형성 때문에 관계가 없는 줄기 세포 주사의 계정은 이미 여러 임상 설정3,,45에 보고 되었습니다. 기형종 형성을 위한 잠재력은 가장 자주 만능 줄기 세포 (PSC) 개발에서 임상 관심사를 인용 했다 지연 및 여러 높은 프로필 배아 줄기 세포 (ESC)의 취소 귀착되 고 유도 만능 줄기 세포 (iPSC) 실험6,7,,89. 따라서, 이러....

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프로토콜

이 동물 실험 승인 하 고 제도적 검토 보드와 스탠포드 대학에서 실험실 동물 관리에 관리 패널에서 수행 했다.

1. Ipsc의 세포 배양

  1. 인간의 Ipsc lentiviral 프로그래밍 6 잘 플레이트 지하실 멤브레인 매트릭스 (예: matrigel, 라고도 매트릭스 hereon) 코팅에 의해 파생 된 성장.
  2. 매일 변경 풍부한 문화 매체와 Ipsc의 미디어 (참조 테이블의 자료) 37 ° C, 5% CO2배양.
  3. 일단 셀 도달 80-90% 합류 (약 매 4 일), 추가 재조합 세포 분리 효소의 1 mL ( 재료의 표참조) 당 잘 하 고 5 분 동안 37 ° C에서 품 어.
  4. 5 분 후 pipetting으로 우물에서 세포를 분리 하 고 15 mL 튜브에 그들을 전송 300 x g에서 원심.
  5. 원심, 후는 상쾌한 발음 고 풍부한 문화 매체로 셀 펠 릿 resuspend 1:1,000 희석에서 Y27632 억제 물 농축 ( 재료의 표참조).
  6. 천연된 셀의 셀 수를 수행 하 고 4 × 1052 x 10

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결과

일반적으로 주입 된 쥐 씨 (그림 2)를 영상으로 확인 4-8 주 후 기형종 성장 형성을 시연할 예정 이다. 종양은 luciferase 신호 (그림 2)에서 크게 감소의 결과로 주어진 셀 납품 후 1 개월 18 Gy의 누적 복용량 방사선 때 극적으로 축소 됩니다. 중요 한 것은, 정상 조직의 조사 사이트에서 5mm를 가져온 어떤 상당한 피해 (그림 3)에 표시 되지 않습니다.

figure-results-1
그림 1: EBRT와 종양의 치료에 대 한 프로토콜의 도식.

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토론

전 임상 데이터와 "줄기 세포 관광"의 피해자에서 일화 적인 사례 teratomas를 개발의 위험 PSC 치료23와 관련 된 심각한 단점이 되는지 확인 합니다. 방지 하 고 치료 하는 줄기 세포 치료와 관련 된 종양 약 위험 주의 접근의 발달은, 그러므로, 재생 줄기 세포 치료의 임상 번역 촉진에 중요 한 단계. 이 문서에서 우리는 PSC 관련 teratomas EBRT를 사용 하 여 마우스 모델에서의 치료 대상으로 하는 방법을 설명 하 고 씨 이미지를 사용 하 여 조사 종양의 동적 위축 보여주었다.

우리 인간의 Ipsc 활용 lentivirus 메서드를 프로그래밍 하 여 만든 고 정리 teratomas vivo에서 형성 누드 마우스 모델에 주입. 누드 마우스를 사용 하 여 셀의 간 종 주입 초기 면역성 거부를 방지합니다. 면역 결핍 쥐를 사용 하 여 potentiates tumorigenic 잠재력, 동안 동일한 프로토콜 immunoc.......

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

저자는 국립 연구소의 건강 R01 HL134830 (PKN), K08 HL135343 (KS), 및 5F32HL134221를 감사 하 고 싶습니다 (JWR); 하 워드 휴즈 의학 연구소 (ASL); 그리고 그들의 지원에 대 한 스탠포드 심장 혈관 연구소 (ASL).

....

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
유도 만능 줄기 세포 제어 라인Stanford UniversityNguyen Lab세포 배양 iPSC
Corning matrigel 기저막 매트릭스 354234Fisher ScientificCB-40234iPSC
Essential 8 배양 배지ATCC-The global bioresource center30-2203iPSC
Tryple EGibco12605-036의 세포 배양iPSC
Y27632 억제제 2 HCL (ROCK Inhibitor)Fisher ScientificS104950MGiPSC
렌티바이러스CyagenP170721-1001cjn이중 융합 리포터 유전자를 이용한 iPSC 형질도입
폴리르브레네 감염/형질주입 시약Millipore SigmaTR-1003-G이중 융합 리포터 유전자
를 이용한 iPSC 형질도입유비퀴틴 프로모터에 의해 구동되는 Fluc-eGFP 리포터 유전자스탠포드 대학교샘 갬비르 연구소 이중융합 리포터 유전자를 이용한 iPSC의 형질도입
D-루시페린퍼킨 엘머122799이중 융합 리포터 유전자와 BLI
유세포 분석기 (BD FACSARIA III)BD Biosciences FACSAria이중 융합 리포터 유전자를 사용한 iPSC의 트랜스duction
(Glomax Navigator System)Promega Bio Systems, Sunnyvale, CAGM2000이중 융합 리포터 유전자를 이용한 iPSC 트랜스duction
Xenogen IVIS 200 Perkin Elmer124262BLI
IsofluraneSigma-AldrichCDS019936조사
X-Rad SmART 이미지 유도 조사기 Precision X-ray Inc., North Branford, CTX-Rad SmART조사
RT_Image 소프트웨어 패키지Stanford University (http://rtimage.sourceforge.net/)RT_Image v0.2β방사선 조사
의 세포 배양 의 세포 배양 를 이용한 iPSC의 형질도입 (BD FACSARIA III)

참고문헌

  1. Sallam, K., Wu, J. C. Embryonic stem cell biology: insights from molecular imaging. Methods in Molecular Biology. 660, 185-199 (2010).
  2. Lee, A. S., Tang, C., Rao, M. S., Weissman, I. L., Wu, J. C. Tumorigenicity as a clinical hurdle for pluripotent stem cell therapi....

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