Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

एक Vivo माउस मॉडल में भोली CD4 टी सेल सक्रियण, प्रसार और Th1 अस्थि मज्जा द्वारा प्रेरित भेदभाव-व्युत्पंन वृक्ष कोशिकाओं को मापने के लिए

Published: August 22, 2018 doi: 10.3791/58118
Automatic Translation
1, 1, 2, 1,2,3
1LamImSys Lab, Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Carlos III (CNIC), 2LamImSys Lab, Instituto de Investigación Sanitaria Hospital 12 de Octubre (imas12), 3CIBER de Enfermedades Cardiovasculares

Summary

यहां, हम में vivo संकल्प के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद भोली CD4 टी सेल (टी सेल) सक्रियकरण, प्रसार, और Th1 जीएम द्वारा प्रेरित-सीएसएफ अस्थि मज्जा (बी एम)-व्युत्पंन वृक्ष कोशिकाओं (dc) । इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल का वर्णन बीएम और टी सेल अलगाव, डीसी पीढ़ी, और डीसी और टी सेल adoption हस्तांतरण ।

Abstract

ठहराव की भोली CD4 टी सेल सक्रियण, प्रसार, और टी सहायक 1 (Th1) कोशिकाओं को भेदभाव एक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में टी कोशिकाओं द्वारा निभाई गई भूमिका का आकलन करने के लिए एक उपयोगी तरीका है । इस प्रोटोकॉल का वर्णन इन विट्रो अस्थि मज्जा (बीएम) progenitors के granulocyte मैक्रोफेज कॉलोनी-उत्तेजक फैक्टर (जीएम-सीएसएफ) व्युत्पंन-वृक्ष कोशिकाओं (dc) प्राप्त करने के लिए में भेदभाव । प्रोटोकॉल भी ovalbumin पेप्टाइड के दत्तक हस्तांतरण का वर्णन (OVAp)-लोड जीएम-सीएसएफ-व्युत्पंन dc और भोली CD4 टी कोशिकाओं OTII ट्रांसजेनिक चूहों से आदेश में vivo सक्रियण, प्रसार, और Th1 विभेद का विश्लेषण करने के लिए CD4 टी कोशिकाओं का तबादला. इस प्रोटोकॉल में विशुद्ध रूप से vivo की सीमा को विशेष रूप से हेरफेर या अध्ययन सेल जनसंख्या का चयन करने के लिए अक्षमता द्वारा लगाए गए तरीकों को दरकिनार । इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल में एक vivo वातावरण में अध्ययन की अनुमति देता है, इस प्रकार कार्यात्मक कारकों में परिवर्तन से परहेज है कि इन विट्रो में हो सकता है और सेल प्रकार और अंय कारकों के प्रभाव के साथ ही बरकरार अंगों में पाया । प्रोटोकॉल dc और टी कोशिकाओं है कि अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को संशोधित करने में परिवर्तन पैदा करने के लिए एक उपयोगी उपकरण है, संभवतः महत्वपूर्ण परिणाम प्रदान करने के लिए मूल या कई प्रतिरक्षा जुड़े रोगों के विकास को समझते हैं ।

Introduction

CD4 टी कोशिकाओं और प्रतिजन पेश कोशिकाओं (APCs) ऐसे dc के रूप में सूक्ष्म जीवाणु रोगजनकों के लिए प्रतिरक्षा के मध्यस्थों की आवश्यकता है1,2. परिधीय लसीकावत् अंगों में, CD4 टी कोशिकाओं APCs3,4,5द्वारा प्रस्तुत विशिष्ट एंटीजन की पहचान पर सक्रिय कर रहे हैं । सक्रिय CD4 टी कोशिकाओं पैदा करना और अलग विशिष्ट प्रभाव वें कोशिकाओं है कि एक सही अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया6,7के विकास के लिए आवश्यक है में अंतर । इन प्रक्रियाओं के नियंत्रण हानिकारक ऊतक नुकसान8उत्पादन के बिना रोगज़नक़ को मारता है कि एक पर्याप्त अनुकूली रक्षा के उत्पादन के लिए महत्वपूर्ण है । गु कोशिकाओं अभिव्यक्ति या सतह अणुओं, प्रतिलेखन कारकों, और प्रभाव साइटोकिंस के उत्पादन के अनुसार परिभाषित कर रहे है और रोगजनकों के जवाब में आवश्यक और सटीक कार्य प्रदर्शन1। Th1 सेल सबसेट की कोशिकाओं प्रतिलेखन कारक टी शर्त और cytokine इंटरफेरॉन γ (IFNγ) एक्सप्रेस और intracellular रोगजनकों के खिलाफ मेजबान रक्षा में भाग1। ठहराव की भोली CD4 टी कोशिका सक्रियण, प्रसार, और Th1 भेदभाव एक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में भूमिका टी कोशिकाओं का आकलन करने का एक उपयोगी साधन है ।

इस प्रोटोकॉल में vivo की क्षमता का विश्लेषण में सक्षम बनाता है इन विट्रो-उत्पंन बीएम-व्युत्पंन dc के लिए सक्रियण, प्रसार, और भोली CD4 टी कोशिकाओं के Th1 भेदभाव मिलाना । प्रोटोकॉल भी भोली CD4 टी कोशिकाओं की क्षमता का आकलन करने के लिए सक्रिय हो, पैदा करना को प्रेरित कार्य करता है, और Th1 विभेदित (1 चित्रा) । इस बहुमुखी प्रोटोकॉल को विशेष रूप से हेरफेर या विशुद्ध रूप से vivo प्रोटोकॉल में अध्ययन सेल जनसंख्या का चयन करने में असमर्थता दरकिनार । विभिंन अणुओं और dc पर उपचार के प्रभाव से बीएम का उपयोग करके अध्ययन किया जा सकता है आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों5 या इलाज या आनुवंशिक रूप से अलग बीएम कोशिकाओं9से जोड़ तोड़ । इसी प्रकार, टी सेल प्रतिक्रियाओं अलग स्रोतों से या कई जोड़तोड़3,8,10के बाद अपनाने स्थानांतरण के लिए टी कोशिकाओं को प्राप्त करने के द्वारा पता लगाया जा सकता है ।

इस प्रोटोकॉल का मुख्य लाभ दोहरा हैं । टी सेल सक्रियण, प्रसार, और Th1 भेदभाव एक प्रवाह cytometry दृष्टिकोण के साथ विश्लेषण कर रहे हैं; और इस के साथ vivo अध्ययन में संयुक्त है, इस प्रकार परिवर्तन है कि इन विट्रो में हो सकता है और सेल प्रकार और अंय कारक केवल बरकरार अंगों11में पाया सहित टल ।

महत्वपूर्ण रंजक का उपयोग रेडियोधर्मिता के उपयोग से परहेज करते हुए सेल प्रसार को ट्रैक करने के लिए एक व्यापक रूप से इस्तेमाल तकनीक है । इन रिएजेंट के साथ प्रसार की माप कोशिका विभाजन के बाद डाई कमजोर पड़ने पर आधारित है । इसके अलावा, इन रंगों कई तरंग दैर्ध्य में पता लगाया जा सकता है और आसानी से कई फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी या मार्कर के साथ संयोजन में प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण कर रहे हैं । हम कैसे टी सेल सक्रियण, प्रसार दिखाकर इस प्रोटोकॉल की उपयोगिता पर प्रकाश डाला, और Th1 भेदभाव प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं Fundación Centro Nacional de Investigaciones हृदयों कार्लोस III (CNIC) और कोमुनिदाद Autónoma de मैड्रिड के अनुसार स्पेनिश और यूरोपीय दिशानिर्देश के साथ अनुमोदित किया गया । चूहों विशिष्ट रोगज़नक़ मुक्त (SPF) शर्तों में नस्ल थे और कार्बन डाइऑक्साइड (CO2) साँस लेना द्वारा euthanized थे ।

1. Tibias और Femurs से माउस अस्थि मज्जा कोशिकाओं का अलगाव

नोट: C57BL/6 congenic माउस तनाव विभेदक ल्युकोसैट मार्कर Ptprcएक, आम तौर पर सीडी 45.1 या 5.1 के रूप में मांयता प्राप्त किया जाता है, जबकि जंगली प्रकार C57BL उपभेदों Ptprcबी एलील, सीडी 45.2 या 5.2 के रूप में जाना जाता ले । सीडी 45.1 और सीडी 45.2 वेरिएंट एंटीबॉडी का उपयोग कर प्रवाह cytometry द्वारा प्रतिष्ठित किया जा सकता है । cd 45.1, cd 45.2, और cd 45.1/cd 45.2 चूहों को कक्ष सूत्रों के रूप में या दत्तक अंतरण के लिए प्राप्तकर्ताओं के रूप में उपयोग किया जा सकता है, प्रवाह cytometry द्वारा विशिष्ट कोशिका आबादी की अनुरेखण की अनुमति । अधिमानी उंर के 12 सप्ताह से कम आयु और लिंग मिलान पुरुष या मादा चूहों का उपयोग करें ।

  1. Femurs और Tibias की तैयारी
    1. Euthanize चूहों संस्थागत पशु देखभाल समिति द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल का उपयोग कर ।
    2. ७०% इथेनॉल के साथ पशु की सतह के छिड़काव से हिंद अंगों को संक्रमित ।
    3. बाँझ कैंची, संदंश और नश्तर का उपयोग करें । एक स्केलपेल के साथ, त्वचा में कटौती करने और पीछे के अंगों को कवर त्वचा सहित माउस के बाहर के हिस्से से त्वचा को हटा दें । छील कम बछड़ा मांसपेशियों के आसपास की त्वचा और पैरों से त्वचा को पूरी तरह से हटा (चित्रा 2a, बी) ।
    4. एक स्केलपेल का उपयोग कर फीमर से quadriceps मांसपेशी अलग । फीमर सिर को तोड़ने के बिना संयुक्त कूल्हे को स्पष्ट । एक स्केलपेल (चित्रा 2c2d) का उपयोग कर टिबिया से मांसपेशियों को हटा दें । हड्डी समाप्त होने पर बिना टिबिया से फीमर को अलग कर दीजिये ।
    5. हड्डियों को एक पेट्री डिश में रखें जिसमें 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और आइस-कोल्ड 1x रोसवेल Park मेमोरियल इंस्टिट्यूट (RPMI) १६४० मीडियम में 1% पेनिसिलिन/streptomycin हैं ।
  2. सेल अलगाव
    नोट: सभी क्रमिक कदम एक संस्कृति हूड के तहत और बाँझ सामग्री के साथ किया जाना चाहिए संक्रमण से बचने के लिए.
    1. एक बाँझ पेट्री पकवान में, ध्यान से एक स्केलपेल के साथ प्रत्येक हड्डी के समीपस्थ और बाहर के सिरों को काट ।
    2. गर्म पूरा RPMI मध्यम (RPMI + 10% FBS, 2 मिमी EDTA, 1% पेनिसिलिन/streptomycin, 20 मिमी HEPES, ५५ µ एम 2-mercaptoethanol, 1 मिमी सोडियम पाइरूवेट, और 2 मिमी एल-glutamine) के 10 मिलीलीटर की कुल मात्रा के साथ हड्डियों को एक बार फ्लश । दोनों सिरों से हड्डियों फ्लश एक 25 जी एक 1 मिलीलीटर सिरिंज से जुड़ी सुई का उपयोग कर समाप्त होता है ।
    3. एक ७० µm नायलॉन वेब फिल्टर के साथ सज्जित एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब करने के लिए effluate स्थानांतरण । ध्यान से कोमल सरगर्मी और pipetting द्वारा मलबे और सेल कंपनियों को उखाड़ फेंकना ।
    4. कमरे के तापमान (आरटी) में 10 मिनट के लिए २५० x g पर सेल निलंबन केंद्रापसारक ।
    5. ठंडा लाल रक्त कोशिका lysis बफर के 1 मिलीलीटर में सेल गोली resuspend (०.१५ मीटर NH4सीएल + 1 मिमी KHCO3 + ०.१ mm EDTA, 1 एन एचसीएल, ०.४ µm बाँझ फ़िल्टर के साथ ७.२ के लिए पीएच समायोजित, और 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत) । हाथ मिलाने के साथ 5 मिनट के लिए बर्फ पर बनाए रखें ।
    6. ठंड बफर के 10 मिलीलीटर जोड़ें (1x फास्फेट बफर खारा (पंजाब) + 2 मिमी EDTA + 2% गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA)) को निष्क्रिय और लाल रक्त कोशिका lysis बफर बाहर धोने ।
    7. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए २५० x g पर सेल सस्पेंशन केंद्रापसारक ।
    8. पूर्ण RPMI मध्यम के 25 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को धोने और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए २५० x g पर केंद्रापसारक ।
    9. पूर्ण RPMI मध्यम के 5 मिलीलीटर में कोशिकाओं resuspend । trypan ब्लू के साथ सेल सस्पेंशन 1:1 के ५० µ एल मिक्स । एक खुर्दबीन के नीचे एक मतगणना कक्ष में कक्ष संख्या निर्धारित करें । सूत्र का उपयोग करके कक्ष संख्या परिकलित करें: कक्ष/mL = [(गैर-सना हुआ कक्ष गणना/4) x 2 x १०,०००]12.
      नोट: इस विधि पैदावार ४० x 106 से ६० x 106 अस्थि मज्जा कोशिकाओं के प्रति संक्रमित 8 से 12 सप्ताह पुराने C57BL/
    10. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए २५० x g पर सेल सस्पेंशन केंद्रापसारक ।

2. डीसी विभेद, परिपक्वता और प्रतिजन लोड हो रहा है

  1. बीएम सेल हार्वेस्टिंग
    1. बीज पर पूर्ण संस्कृति 6-अच्छी तरह से अल्ट्रा कम लगाव सतह प्लेटों पर 10 मध्यम प्रति मिलीलीटर, आम तौर पर 5 मिलीलीटर में अच्छी तरह से प्रति कोशिकाओं । विभेदित मैक्रोफेज कल्चर-प्लेट्स को अटैच करेंगे. 12 ज के बाद, supernatant, जो मुख्य रूप से monocytes शामिल हैं, 6-well प्लेट्स को साफ करने के लिए, पुराने 6-अच्छी तरह से प्लेटों का पालन मैक्रोफेज के साथ खारिज ।
    2. सेल विभेद को बढ़ावा देने के लिए, संस्कृति गैर-अनुयाई कोशिकाओं पर 5 x 105 प्रति मिलीलीटर में आम तौर पर 5 मिलीलीटर के प्रति अच्छी तरह से पूर्ण RPMI मध्यम 20 एनजी/एमएल युक्त रिकॉमबिनेंट murine जीएम-सीएसएफ पर ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% कार्बन डाइऑक्साइड (2CO) और पुण्यतिथि दै.
    3. हर 3 दिन, निलंबित कोशिकाओं को नीचे स्पिन और पंजाब में 5 मिमी EDTA के साथ अनुयाई कोशिकाओं को इकट्ठा करने और नीचे स्पिन । संयुक्त और 5 x 105 कोशिकाओं/मिलीलीटर में ताजा माध्यम से 20 एनजी/एमएल rm-जीएम-सीएसएफ शामिल है ।
    4. दिन 8 पर, ऊपर के रूप में अनुयाई और अलग कोशिकाओं को इकट्ठा करने और 5 x 105 कोशिकाओं में/एमएल 20 एनजी/एमएल जीएम-सीएसएफ और 20 एनजी/एमएल lipopolysaccharide (एलपीएस) में 24 ज के लिए एक गैर ऊतक संस्कृति-इलाज बाँझ पेट्री पकवान, उच्च MHC-II प्रेरित करने के लिए , CD80 आणि CD86 अभिव्यक्ति.
    5. चरण २.२ में इंगित के रूप में प्रवाह cytometry द्वारा DC विभेदन की जाँच करें ।
  2. प्रवाह Cytometry विभेद और परिपक्वता विश्लेषण ।
    1. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए २५० x g पर सेल सस्पेंशन केंद्रापसारक । इस चरण को दो बार दोहराएं ।
    2. ब्लॉक एफसी रिसेप्टर्स माउस एफसी रिसेप्टर अवरोधक (शुद्ध विरोधी माउस CD16/CD32 आईजीजी 2बी एंटीबॉडी) 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर निर्माता के निर्देशों के अनुसार में resuspend सेल गोली से ।
    3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए २५० x g पर सेल सस्पेंशन केंद्रापसारक ।
    4. प्रत्येक जांच के लिए, प्रवाह cytometry बफर के ३०० µ एल में २५०,००० कोशिकाओं को फिर से सस्पेंड (1x पंजाबियों + 2 मिमी EDTA + 2% BSA) 4 डिग्री सेल्सियस पर ।
    5. अच्छी तरह से एक ९६-अच्छी थाली के प्रति सेल समाधान के 30 µ एल स्थानांतरण ।
    6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए २५० x g पर सेल सस्पेंशन केंद्रापसारक ।
    7. supernatant छोड़ें और एंटीबॉडी-युक्त बफ़र के 30 µ l को एक अच्छी तरह से निर्माता के संकेत का अनुसरण करने के लिए जोड़ें । 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए एंटीबॉडी के साथ कोशिकाओं की मशीन ।
      नोट: आमतौर पर dc, monocytes, और मैक्रोफेज के लिए कार्यरत मार्कर CD11b, CD64, CD115, CD11c, MHCII, CD80, और CD86 (चित्रा 3) हैं ।
    8. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए २५० x g पर नमूने केंद्रापसारक और २०० µ एल में ठंडा प्रवाह cytometry बफर के प्रति अच्छी तरह से resuspend एक मार्कर युक्त मृत कोशिकाओं को बाहर करने के लिए (जैसे, propidium आयोडाइड, 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) या एक अमीन-प्रतिक्रियाशील डाई ) में निर्माता की सिफारिश की एकाग्रता13.
    9. cytometry ट्यूबों प्रवाह और 0, 3, 6 और 9 दिनों पर मृत कोशिकाओं को छोड़कर प्रवाह cytometry विश्लेषण प्रदर्शन करने के लिए नमूनों को स्थानांतरित करके सेल विभेद मॉनिटर ।
  3. DC Antigen लोड कर रहा है ।
    1. 8 दिन पर, 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए २५० x g पर नमूने केंद्रापसारक और २०० µ एल मध्यम (RPMI + 10% FBS एंटीबायोटिक दवाओं के बिना) में छर्रों resuspend । इस चरण को दो बार दोहराएं ।
    2. 10 µ g/mL OVAp (323-339 के साथ dc की मशीन; ISQAVHAAHAEINEAGR) प्रति 1 x 107 dc में 1 मिलीलीटर (RMPI + 1% FBS) एक प्लास्टिक ट्यूब में ३७ डिग्री सेल्सियस से कम 30 मिनट के लिए । नॉन OVAp-लोडेड dc एक ऋणात्मक नियंत्रण शर्त के रूप में उपयोग करें ।
    3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए २५० x g पर नमूने केंद्रापसारक और २०० µ l पूरा RPMI माध्यम में छर्रों resuspend । इस चरण को दो बार दोहराएं ।
    4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए २५० x g पर नमूने केंद्रापसारक और २०० µ एल मध्यम में छर्रों (RPMI + 10% FBS) 2 x 106 कोशिकाओं/

3. OTII चूहों से भोली CD4 टी कोशिकाओं का अलगाव

नोट: इस विधि पैदावार लगभग १०० x 106 spleenocytes प्रति संक्रमित 8 से 12 सप्ताह पुराने C57BL/ दोनों पुरुषों और महिलाओं को इस्तेमाल किया जा सकता है । CD4 टी कोशिकाओं तिल्ली या लिम्फ नोड्स से अलग किया जा सकता है; CD4 टी कोशिकाओं लगभग 25% और इन अंगों में कोशिकाओं के ५०% के लिए खाते, क्रमशः । बाँझ स्थितियों में निम्न चरणों का पालन करें ।

  1. वंक्षण, कांख, बाहु, ग्रीवा, और mesenteric लिम्फ नोड्स और OTII ट्रांसजेनिक चूहों (चित्रा 4) से तिल्ली को अलग और एक प्लास्टिक पेट्री पूर्ण RPMI माध्यम के 10 मिलीलीटर युक्त पकवान के लिए उन्हें हस्तांतरण.
  2. पूरे RPMI मीडियम के 2 मिलीलीटर के साथ सेल छलनी को कुल्ला करें और इसे ५० एमएल ट्यूब से निकाल दें । एक ५० मिलीलीटर ट्यूब में रखा एक ७० µm सेल छलनी करने के लिए लिम्फ नोड्स और तिल्ली स्थानांतरण । Homogenize एक सिरिंज गोताख़ोर (चित्रा 5) का उपयोग कर और मध्यम जोड़ने के लिए 15 मिलीलीटर.
  3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए २५० x g पर नमूने केंद्रापसारक और पूरा RPMI माध्यम के 15 मिलीलीटर में गोली resuspend । इस चरण को दो बार दोहराएं ।
  4. तिल्ली सेल निलंबन के लिए, सेल गोली resuspend और चरण 1.2.5 में संकेत के रूप में लाल रक्त कोशिकाओं लाइसे.
  5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए २५० x g पर सेल सस्पेंशन केंद्रापसारक ।
  6. पूर्ण RPMI मध्यम के 25 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को धो और आरटी में 5 मिनट के लिए २५० x g पर केंद्रापसारक ।
  7. मध्यम के 5 मिलीलीटर में कोशिकाओं resuspend । Trypan ब्लू के साथ सेल सस्पेंशन 1:1 के ५० µ एल मिक्स । एक खुर्दबीन के नीचे एक गिनती चैंबर का उपयोग कर सेल संख्या निर्धारित करें । सूत्र का उपयोग करके कक्ष संख्या परिकलित करें: कक्ष/mL = [(गैर-सना हुआ कक्ष गणना/4) x 2 x १०,०००]12.
  8. चरण -8 दोहराएँ ।
  9. निर्माता के निर्देशों के बाद, CD8α, आईजीएम, B220, CD19, MHCII (मैं Ab), CD11b, CD11c, CD44, CD25, और DX5 टी कोशिकाओं के बाद में नकारात्मक चयन के लिए बर्फ पर 30 मिनट के लिए के लिए biotinylated एंटीबॉडी के 1:800 कमजोर पड़ने के साथ कोशिकाओं को गर्मी ।
  10. निर्माता के निर्देशों के बाद और कोशिकाओं की संख्या और मोतियों की क्षमता के आधार पर, streptavidin-लेपित चुंबकीय microbeads की आवश्यक मात्रा की गणना और एक चुंबकीय कक्ष विभाजक का उपयोग कर CD4 टी कोशिकाओं को अलग और उपयुक्त पृथक्करण स्तंभ ।
  11. पूर्ण RPMI मध्यम के 5 मिलीलीटर में कोशिकाओं resuspend और ३.७ कदम में वर्णित के रूप में जीवित कोशिकाओं गिनती जबकि बर्फ पर उन्हें रखने के लिए ।
  12. 2 एक्स 105 कोशिकाओं को निकालने और एकत्रित कोशिकाओं की शुद्धता की जांच एक प्रवाह में विरोधी CD4, CD3, B220 और सीडी 8 फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी का उपयोग cytometer निर्माता का उपयोग कर-एंटीबॉडी कमजोर पड़ने की सिफारिश की ।
  13. पृथक भोली CD4/OTII टी कोशिकाओं दाग, ५०० µ एल बफर में 106 कोशिकाओं resuspend (1x पंजाबियों + 2 मिमी EDTA + 2% BSA) । तैयार ५०० µ एल बफर (1x पंजाबियों + 2 मिमी EDTA + 2% BSA) डबल अंतिम निर्माता युक्त-महत्वपूर्ण सेल अनुरेखक डाई की एकाग्रता की सिफारिश की. धीरे कक्ष अनुरेखक समाधान सेल निलंबन करने के लिए जोड़कर दोनों समाधान मिश्रण. ३७ डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए कोशिकाओं की मशीन ।
  14. पूरी RPMI मध्यम के 5 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को धोने और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए २५० x g पर केंद्रापसारक । इस चरण को दो बार दोहराएं । 1 x 107कोशिकाओं/एमएल में पूरा RPMI मध्यम के 1 मिलीलीटर में कोशिकाओं resuspend ।

4. Vivo सक्रियण, प्रसार और Th1 विभेद परख में

नोट: महत्वपूर्ण सेल अनुरेखक डाई carboxyfluorescein diacetate succinimidyl एस्टर (CFSE) और अन्य succinimidyl एस्टर आधारित रंजक है, जो उत्तेजित होते हैं और विभिन्न तरंग दैर्ध्य पर प्रतिदीप्ति का उत्सर्जन करते हैं, व्यापक रूप से प्रवाह द्वारा लिम्फोसाइट प्रसार का आकलन करने के लिए उपयोग किया जाता है उनके उच्च प्रतिदीप्ति तीव्रता, लंबे जीवन, कम परिवर्तनशीलता, और कम विषाक्तता के कारण cytometry14.

  1. Adoptively हस्तांतरण नसों में (i.v.) 1 x 106 जीना महत्वपूर्ण सेल अनुरेखक डाई-सना हुआ भोली CD4/OTII टी कोशिकाओं १०० µ एल में पंजाब के प्रति माउस. लेबल टी कोशिकाओं adoptively पूंछ नस या रेट्रो कक्षीय इंजेक्शन15द्वारा हस्तांतरित किया जा सकता है; दोनों ही मामलों में, कोशिकाओं लसीकावत् अंगों (चित्रा 6A) के लिए घर होगा ।
  2. प्राप्तकर्ता चूहों को चुनौती एक दिन बाद adoptively स्थानांतरण द्वारा १००,००० एलपीएस-परिपक्व OVAp-लोड dc द्वारा footpads (फिगर घमण्ड) में चमड़े के नीचे इंजेक्शन (s.i.) ।
  3. फसल प्राप्तकर्ता चूहों से जानुपृष्ठीय लिम्फ नोड्स और उंहें एक ही कदम के रूप में पहले ३.१ और ३.२ में वर्णित चरणों का पालन एक सेल निलंबन के प्राप्त करने तक की प्रक्रिया । CD4/OTII टी सेल सक्रियकरण को मापने के लिए 2 दिन के बाद प्रतिरक्षण, और 5 दिन पर प्रसार प्लस Th1 विभेद को मापने के लिए ।
  4. 2 दिन पर टी सेल सक्रियण का विश्लेषण करने के लिए, CD4, CD69, और CD25 के खिलाफ फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी के साथ दाग कोशिकाओं (वैकल्पिक सीडी 45.1 और सीडी 45.2) और C69 की आबादी में CD25+CD4+ टी कोशिकाओं का प्रतिशत निर्धारित करते हैं । प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण (चित्रा 7) ।
  5. 5 दिन पर टी सेल प्रसार की जांच करने के लिए, दाग CD4 और वैकल्पिक सीडी 45.1 और सीडी 45.2 के खिलाफ उचित फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी का उपयोग कर कोशिकाओं । प्रवाह cytometry द्वारा CD4 जनसंख्या में महत्वपूर्ण कोशिका अनुरेखक डाई सिग्नल के क्षय का विश्लेषण (चित्रा 8). कई मापदंडों इन अध्ययनों में निर्धारित किया जा सकता है, इस तरह के कक्ष की संख्या के रूप में महत्वपूर्ण कोशिका अनुरेखक डाई के साथ लेबल कोशिकाओं द्वारा आया, प्रत्येक प्रतिदीप्ति चोटी में कोशिकाओं विभाजन का प्रतिशत, और कुल सेल में विभाजन कोशिकाओं का प्रतिशत जनसंख्या.
  6. 5 दिन में Th1 भेदभाव का निर्धारण करने के लिए, प्लेट ४००,००० कोशिकाओं के प्रति अच्छी तरह से एक ९६-अच्छी थाली के २०० µ एल में पूरा RPMI मध्यम से युक्त 1 µ एम ionomycin और 10 एनजी/एमएल phorbol 12 myristate 13 एसीटेट (पमा) के लिए 6 ज में ३७ ° c में मशीन । पिछले 4 घंटे के लिए, जोड़ें 3 – 10 µ g/mL brefeldin A ब्लॉक करने के लिए cytokine स्राव माध्यम करने के लिए.
  7. 4 डिग्री सेल्सियस पर २५० x g पर 5 मिनट के लिए प्लेटें केंद्रापसारक । ९६-अच्छी तरह से थाली के तेजी से उलटा द्वारा supernatant त्यागें ।
  8. चरण -8 दोहराएँ ।
  9. 30 µ में 4 ° c में 15 मिनट के लिए मशीन द्वारा दाग सेल झिल्ली बफर (1x पंजाबियों + 2 मिमी EDTA + 2% BSA) CD4 करने के लिए एंटीबॉडी युक्त और सीडी 45.1 और सीडी 45.2 करने के लिए वैकल्पिक निर्माता-अनुशंसित कमजोर पड़ने पर । (1x पंजाबियों + 2 मिमी EDTA + 2% BSA) बफर के १५० µ एल जोड़कर कोशिकाओं को धो और 4 डिग्री सेल्सियस पर २५० एक्स जी में 5 मिनट के लिए प्लेटें केंद्रापसारक और supernatant त्यागें ।
  10. १०० µ एल के 2% paraformaldehyde/1% सुक्रोज पर 20 मिनट के लिए RT. १,००० x g और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए प्लेटें जोड़कर कोशिकाओं को ठीक करें । supernatant को त्यागें ।
  11. intracellular permeabilization बफर के ५० µ l को जोड़कर कोशिकाओं को Permeabilize (1x पंजाबस + ०.१% BSA, ०.०१ M HEPES, ०.३% saponin) और 4 ° c पर 30 मिनट के लिए मशीन ।
  12. पंजाब के १५० µ एल जोड़ें और 5 मिनट के लिए प्रारंभ में १,००० x g पर supernatant छोड़ें ।
  13. दाग intracellular साइटोकिंस के 30 µ एल जोड़ने के द्वारा fluorophore-संयुग्मित बफर में विरोधी IFNγ एंटीबॉडी (पंजाब + ०.१% saponin) और आरटी में 30 मिनट के लिए मशीन ।
  14. कोशिकाओं को धो बफर के १५० µ एल जोड़कर (पंजाबियों + ०.१% saponin) । 5 मिनट के लिए आरटी पर १,००० x जी में प्लेटें और supernatant त्यागें । इस चरण को दो बार दोहराएं ।
  15. प्रवाह cytometry द्वारा सेल आबादी का विश्लेषण (8 चित्रा) ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

चित्र 1 इस प्रोटोकॉल में वर्णित चरणों को दिखाता है । चित्रा 2 अलगाव और माउस बीएम कोशिकाओं की संस्कृति को दर्शाता है । इन संस्कृतियों के लिए जीएम-सीएसएफ और एलपीएस के अलावा इन विट्रो पीढ़ी और dc की परिपक्वता की अनुमति देता है । चित्रा 3 के विभेद और परिपक्वता प्राप्त dc के प्रवाह cytometry विश्लेषण दिखाता है । OVAp---सीएसएफ बीएम-व्युत्पन्न dc और पृथक महत्वपूर्ण कोशिका ट्रेस डाई-सना हुआ CD4/OTII टी कोशिकाओं adoptively चूहों को हस्तांतरित कर रहे हैं । चित्रा 4 CD4/OTII टी कोशिकाओं के अलगाव के लिए इस्तेमाल लिम्फ नोड्स के स्थान से पता चलता है । चित्रा 5 ७० µm नायलॉन फिल्टर और एक सिरिंज गोताख़ोर लिम्फ नोड्स और तिल्ली homogenize करने के लिए इस्तेमाल के साथ सज्जित एक ५० मिलीलीटर ट्यूब से पता चलता है । चित्रा 6 CD4/OTII टी कोशिकाओं के i.v. इंजेक्शन रेट्रो कक्षीय जाल में और OVAp-लोड जीएम-सीएसएफ बीएम-footpad में dc व्युत्पंन के एस॰सी॰ इंजेक्शन से पता चलता है । CD4/OTII टी कोशिकाओं को विभिंन लसीकावत् अंगों को वितरित, जबकि जीएम-सीएसएफ dc जानुपृष्ठीय लिम्फ नोड्स जहां जीएम-सीएसएफ dc CD4 की प्रस्तुति द्वारा भोली OTII/OVAp टी कोशिकाओं को सक्रिय करने के लिए विस्थापित । भोली CD4/OTII टी कोशिकाओं तो पैदा करना और Th1 phenotype की ओर अंतर. चित्रा 7 झिल्ली CD69 और CD25 अभिव्यक्ति के विश्लेषण से भोली CD4/OTII टी सेल सक्रियण के ठहराव दिखाता है । चित्रा 8 CD4/OTII टी सेल प्रसार के ठहराव से पता चलता है । चित्रा 9 Th1 phenotype के प्रति CD4/OTII टी सेल विभेद के ठहराव को दिखाता है ।

Figure 1
चित्र 1: प्रोटोकॉल योजना । 1), माउस femurs और tibias से बीएम कोशिकाओं को अलग । 2)-जीएम सीएसएफ बीएम व्युत्पंन-dc. 3) डीसी विभेद और परिपक्व जीएम-सीएसएफ बीएम व्युत्पंन-एलपीएस के साथ dc की जांच करने के लिए जीएम-सीएसएफ के साथ संस्कृति बीएम कोशिकाओं । 4) डीसी परिपक्वता की जांच करें । 5) OVAp के साथ लोड dc । 6) CD4/OTII टी कोशिकाओं को अलग माउस तिल्ली फार्म । 7) दाग CD4/OTII टी कोशिकाओं महत्वपूर्ण सेल अनुरेखक डाई के साथ. 8) अलगाव की शुद्धता की जांच करें और महत्वपूर्ण सेल अनुरेखक अलग CD4/OTII टी कोशिकाओं के धुंधला डाई । 9) Adoptively स्थानांतरण पृथक CD4/OTII टी कोशिकाओं प्राप्तकर्ता चूहों को i.v. । 10). Adoptively स्थानांतरण OVAp-लोड और परिपक्व dc एस॰सी॰ करने के लिए प्राप्तकर्ता चूहों । 11) CD4/OTII टी सेल सक्रियण की जांच करें । 12) Check CD4/OTII टी सेल प्रसार और विभेद । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: माउस femurs और tibias से अस्थि मज्जा अलगाव प्रक्रिया । (क) कैंची के साथ त्वचा चीरा । (ख) अंग से त्वचा को हटाना । (ग) कैंची के साथ मांसपेशी चीरा । (घ) एक स्केलपेल के साथ अंग से मांसपेशी को हटाना । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: जीएम-सीएसएफ बीएम-व्युत्पन्न dc की परिपक्वता का प्रवाह cytometry विश्लेषण । MHCII की सतह अभिव्यक्ति, CD80, और CD86 में एलपीएस सक्रिय (+ एलपीएस) और गैर-सक्रिय (-एलपीएस) जीएम-सीएसएफ बीएम-व्युत्पंन dc. numbers मनमाना इकाइयों (प्रतिदीप्ति) में मतलब a.u. तीव्रता दिखाओ । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: वंक्षण, कांख, बाहु, ग्रीवा, और mesenteric लिम्फ नोड्स और चूहों में तिल्ली का स्थान. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: लिम्फ नोड और तिल्ली homogenization के लिए प्रयोगात्मक सेट अप । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6: CD4/OTII टी कोशिकाओं और OVAp लोड जीएम-सीएसएफ बीएम-व्युत्पंन-dc के दत्तक स्थानांतरण । (क) CD4/OTII टी कोशिकाओं के नसों में रेट्रो कक्षीय जाल में इंजेक्शन । (ख) OVAp-लोड जीएम-सीएसएफ बीएम-footpad में प्राप्त dc के चमड़े के नीचे इंजेक्शन । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 7
चित्र 7: vivo मेंT सेल सक्रियण का ठहराव । cytometry भूखंडों और ग्राफ CD4 टी कोशिकाओं में CD69 की झिल्ली अभिव्यक्ति का विश्लेषण और ठहराव दिखा प्रवाह. cd 45.1/cd 45.2 चूहों को adoptively स्थानांतरित किया गया i.v. माउस cd 45.1/CD4/OTII और cd 45.1/CD4/OTII कोशिकाओं के एस॰सी॰ दत्तक स्थानांतरण से पहले 24 एच OVAp----सी. बी. सी. टी सेल सक्रियकरण 2 दिनों के बाद प्रवाह cytometry द्वारा डीसी हस्तांतरण में मापा गया था फ्लोरोसेंट के साथ दाग के बाद, संकेत एंटीजन को एंटीबॉडी टैग की गईं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 8
चित्र 8: vivo मेंT cell जखीरे का ठहराव । प्रवाह cytometry भूखंडों और विश्लेषण और गिरावट महत्वपूर्ण कोशिका अनुरेखक proliferating CD4 टी कोशिकाओं में धुंधला डाई के ठहराव दिखा रेखांकन. सीडी 45.2 चूहों थे adoptively स्थानांतरित i.v. माउस सीडी के साथ 45.1/CD4/OTII कोशिकाओं के एस॰सी॰ दत्तक स्थानांतरण से पहले 24 एच OVAp-लोड जीएम-सीएसएफ बीएम-व्युत्पन्न-dc. T सेल प्रसार पर मापा गया था 5 दिन के बाद प्रवाह cytometry द्वारा डीसी स्थानांतरण के साथ दाग के बाद संकेत फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी । टी सेल प्रसार proliferating कोशिकाओं के प्रतिशत को मापने के द्वारा निर्धारित किया जा सकता है, प्रत्येक डिवीजन चोटी में कोशिकाओं का प्रतिशत, या विभाजन चोटियों की संख्या गिनती के रूप में रेखांकन में दिखाया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 9
चित्र 9: vivo मेंTh1 phenotype के प्रति टी सेल विभेद का ठहराव । cytometry भूखंडों और रेखांकन IFNγ-व्यक्त CD4 टी कोशिकाओं के प्रतिशत के विश्लेषण और ठहराव दिखा प्रवाह । सीडी 45.2 चूहों थे adoptively स्थानांतरित i.v. माउस सीडी 45.1 के साथ CD4/OTII के एस॰सी॰ दत्तक स्थानांतरण से पहले 24 एच-लोड जीएम-सीएसएफ बीएम-व्युत्पंन-dc. T सेल विभेद दिनों में मापा गया था के बाद प्रवाह OVAp द्वारा डीसी स्थानांतरण के साथ धुंधला के बाद संकेत फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी । Th1 phenotype की ओर टी सेल भेदभाव कुल CD4 टी कोशिकाओं के प्रतिशत के रूप में IFNγ-व्यक्त कोशिकाओं के रूप में निर्धारित किया गया था और केवल proliferating CD4 टी कोशिकाओं से. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

इस प्रोटोकॉल की क्षमता के लक्षण वर्णन के लिए अनुमति देता है बीएम-व्युत्पंन dc प्राप्त करने के लिए सक्रियण, प्रसार, और भोले CD4 टी कोशिकाओं के भेदभाव । इसके अलावा, यह भी बीएम-व्युत्पन्न dc द्वारा मॉडुलन करने के लिए CD4 टी कोशिकाओं की संवेदनशीलता का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस प्रोटोकॉल के साथ, इन घटनाओं में परिवर्तन vivo मेंमापा जा सकता है ।

जांच के अंतर्गत परिकल्पना के आधार पर, टी कोशिकाओं और dc के कई संयोजनों का उपयोग किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, एक में दस्तक दे या बाहर विशिष्ट जीन या CD4 टी सेल सक्रियण, प्रसार, या Th1 भेदभाव की एक विशिष्ट उत्तेजना की क्षमता दस्तक के परिणामों का विश्लेषण कर सकते हैं । इन कार्यविधियों को dc या CD4 T कक्षों पर या दोनों कक्ष प्रकार पर किया जा सकता है । इस प्रकार, जंगली प्रकार या आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों से CD4 टी कोशिकाओं जंगली प्रकार चूहों और इसके विपरीत से व्युत्पन्न dc के साथ जोड़ा जा सकता है.

इस प्रोटोकॉल को cytometry और सीडी 45.1 और सीडी 45.2 के खिलाफ एंटीबॉडी प्रवाह का उपयोग करके विभिंन कोशिका आबादी के मूल अंतर अनुकूलित किया जा सकता है । दरअसल, cd 45.1/cd 45.1 और cd 45.2/cd 45.2 चूहों का उपयोग किसी भी संयोजन में अपनाए जाने वाले किसी भी कक्ष प्रकारों के स्रोत के रूप में या इसके लिए प्राप्तकर्ताओं के रूप में किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, CD4 टी कोशिकाओं सीडी 45.1/सीडी 45.1/OTII चूहों से प्राप्त किया जा सकता है, जबकि सीडी 45.2/चूहों डीसी पीढ़ी के लिए बीएम की उत्पत्ति हो सकती है 45.2 । इस प्रयोग में, दोनों कक्ष प्रकार adoptively सीडी 45.1/सीडी 45.2 चूहों को हस्तांतरित किया जा सकता है । इसके अलावा, CD4/OTII टी कोशिकाओं से cd 45.1/cd 45.1 प्रकार एक चूहे और cd 45.2/cd 45.2 प्रकार दो चूहों एक ही या अलग सीडी 45.1 में संयुक्त किया जा सकता है/सीडी 45.2 प्रकार तीन प्राप्तकर्ताओं प्रकार के व्यवहार की तुलना करने के लिए एक और प्रकार दो प्रतिस्पर्धा में CD4 टी सेल आबादी और गैर प्रतिस्पर्धा शर्तों, क्रमशः ।

इस विधि के जीएम-सीएसएफ बीएम-व्युत्पन्न dc की पीढ़ी का वर्णन करता है । हालांकि, वैकल्पिक प्रोटोकॉल डीसी परिपक्वता और भेदभाव के लिए उपलब्ध हैं; उदाहरण के लिए, papain के बजाय एलपीएस या एफएमएस से संबंधित tyrosine कळेनासे 3 ligand (Flt3-एल) के बजाय जीएम-सीएसएफ का इस्तेमाल किया जा सकता है, phenotypically विशिष्ट dc की क्षमता के अध्ययन की अनुमति CD4 टी सेल अनुकूली उन्मुक्ति सक्रिय करने के लिए । इसी इरादे के साथ, antigen लोडिंग और प्रस्तुति के लिए dc सीधे चूहों से पृथक किया जा सकता है । 9 अंय लोगों के साथ इस प्रोटोकॉल का संयोजन CD4/OTII टी कोशिकाओं के वायरल संक्रमण से हेरफेर16 प्राप्तकर्ता चूहों को अपने दत्तक स्थानांतरण से पहले की अनुमति देता है । बीएम भी retroviruses9 के साथ transduced प्रोटोकॉल में उनके उपयोग से पहले dc पर नियंत्रित सेल संशोधनों के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है ।

इसके अतिरिक्त, इस प्रोटोकॉल फ्लोरोसेंट प्रोटीन-व्यक्त कोशिकाओं का उपयोग करके intravital माइक्रोस्कोपी अध्ययन17 के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, CD4/OTII चूहों GFP-या चेरी-व्यक्त चूहों GFP या चेरी/OTII CD4 चूहों को प्राप्त करने के लिए के साथ पार किया जा सकता है । इन चूहों तो CD4 टी कोशिकाओं के एक स्रोत के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है और vivo प्रयोगों में की आवश्यकता के रूप में चेरी-या GFP-व्यक्त चूहों, से बीएम व्युत्पंन dc के साथ जोड़ा जा सकता है ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है

Acknowledgments

हम अंग्रेजी संपादन के लिए डॉ साइमन बार्टलेट धंयवाद । इस अध्ययन Instituto de Salud कार्लोस III (ISCIII) (PI14/00526 से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था; PI17/01395; CP11/00145; CPII16/00022), Miguel Servet कार्यक्रम और Fundación रामोन Areces; Fondo Europeo de Desarrollo क्षेत्रीय (FEDER) से सह-धन के साथ । CNIC अर्थव्यवस्था, उद्योग और प्रतिस्पर्धात्मकता (MEIC), और प्रो CNIC फाउंडेशन के मंत्रालय द्वारा समर्थित है और उत्कृष्टता के एक Severo Ochoa केंद्र (SEV-2015-0505) है । RTF द्वारा स्थापित किया गया है Fundación रामोन Areces और CNIC, VZG द्वारा ISCIII, BHF द्वारा Instituto de Investigación Sanitaria अस्पताल 12 de अक्टूबर, (imas12) और JMG-G द्वारा ISCIII Miguel Servet कार्यक्रम और imas12.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ethanol VWR Chemicals 20,824,365 5 L
Scissors Fine Science Tools (F.S.T.) 14001-12
Forceps Fine Science Tools (F.S.T.) 11000-13
Fine Forceps Fine Science Tools (F.S.T.) 11253-20
Scalpel Fine Science Tools (F.S.T.) 10020-00 Box of 100 blades
Fetal Bovine Serum SIGMA F7524
Penicillin/streptomycin LONZA DE17-602E
Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) GIBCO 21875-034
Sterile Petri dishes Falcon 353003
25-gauge needle BD Microlance 3 300600
1 ml syringe Novico N15663
15 ml conical tubes Falcon 352096
50 ml conical tubes Falcon 352098
70 μm nylon web filter BD Falcon 352350
Red blood lysis buffer SIGMA R7757 100 Ml
EDTA SIGMA ED2SS-250
Bovine Serum Albumin SIGMA A7906 100 g
Trypan blue SIGMA 302643-25G
Culture-plates Falcon 353003
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) Cambrex BE17-737E
Beta-mercaptoethanol Merck 8-05740-0250
Sodium pyruvate LONZA BE13-115E
L-glutamine LONZA BE17-605E
Recombinant murine Granulocyte Macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) Prepotech 315-03
lipopolysaccharide (LPS) SIGMA-ALDRICH L2018
96-well-plate Costar 3799
v450 anti-mouse CD11b antibody BD Biosciences 560455
PE anti-mouse CD64 antibody BioLegend 139303
PE anti-mouse CD115 antibody BioLegend 135505
FITC anti-mouse CD11c antibody BioLegend 117305
FITC anti-mouse MHCII antibody BioLegend 125507
APC anti-mouse CD86 antibody BioLegend 105011
APC anti-mouse CD80 antibody BioLegend 104713
Flow Cytometry tubes Zelian 300800-1 PS 12X75 5mL
OTII Ovoalbumine peptide InvivoGen 323-339
anti-mouse biotinylated CD8α antibody Tonbo Biosciences 30-0081-U500
anti-mouse biotinylated IgM antibody BioLegend 406503
anti-mouse biotinylated B220 antibody Tonbo Biosciences 30-0452-U500
anti-mouse biotinylated CD19 antibody Tonbo Biosciences 30-0193-U500
anti-mouse biotinylated MHCII (I-Ab) antibody BioLegend 115302
anti-mouse biotinylated CD11b antibody Tonbo Biosciences 30-0112-U500
anti-mouse biotinylated CD11c antibody BioLegend 117303
anti-mouse biotinylated CD44 antibody BioLegend 103003
anti-mouse biotinylated CD25 antibody Tonbo Biosciences 30-0251-U100
anti-mouse biotinylated DX5 antibody BioLegend 108903
streptavidin-coated magnetic microbeads MACS Miltenyi Biotec 130-048-101
Magnetic cell separator MACS Miltenyi Biotec 130-090-976 QuadroMACS Separator
Separation columns MACS Miltenyi Biotec 130-042-401
PE anti-mouse CD4 antibody BioLegend 100408
APC anti-mouse CD3 antibody BioLegend 100235
FITC anti-mouse CD8 antibody Tonbo Biosciences 35-0081-U025
Cell Violet Tracer Thermofisher C34557
APC anti-mouse CD25 antibody Tonbo Biosciences 20-0251-U100
Alexa647 anti-mouse CD69 antibody BioLegend 104518
PerCPCY5.5 anti-mouse CD45.1 antibody Tonbo Biosciences 65-0453
APC anti-mouse CD45.1 antibody Tonbo Biosciences 20-0453
PECY7 anti-mouse CD45.1 antibody Tonbo Biosciences 60-0453
FITC anti-mouse CD45.2 antibody Tonbo Biosciences 35-0454
Ionomycin SIGMA-ALDRICH I0634
Phorbol 12 Myristate 13 Acetate (PMA) SIGMA P8139
Brefeldin A (BD GolgiPlug) BD 555029
Paraformaldehyde Millipore 8-18715-02100
Intracellular permeabilization buffer eBioscience 00-8333
APC anti-mouse IFNg antibody Tonbo Biosciences 20-7311-U100
Fc-block (anti-mouse CD16/CD32) Tonbo Biosciences 70-0161-U100
B6.SJL CD45.1 mice The Jackson Laboratory 002014
BD LSRFortessa™ Cell Analyzer BD Biosciences 649225
DAPI Solution Thermofisher 62248

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhu, J., Yamane, H., Paul, W. E. Differentiation of effector CD4 T cell populations (*). Annual Review of Immunology. 28, 445-489 (2010).
  2. Bustos-Moran, E., Blas-Rus, N., Martin-Cofreces, N. B., Sanchez-Madrid, F. Orchestrating Lymphocyte Polarity in Cognate Immune Cell-Cell Interactions. International Review of Cell and Molecular Biology. 327, 195-261 (2016).
  3. Gonzalez-Granado, J. M., et al. Nuclear envelope lamin-A couples actin dynamics with immunological synapse architecture and T cell activation. Science Signaling. 7 (322), ra37 (2014).
  4. Rocha-Perugini, V., Gonzalez-Granado, J. M. Nuclear envelope lamin-A as a coordinator of T cell activation. Nucleus. 5 (5), 396-401 (2014).
  5. Rocha-Perugini, V., et al. CD9 Regulates Major Histocompatibility Complex Class II Trafficking in Monocyte-Derived Dendritic Cells. Molecular and Cellular Biology. 37 (15), (2017).
  6. Kaech, S. M., Wherry, E. J., Ahmed, R. Effector and memory T-cell differentiation: implications for vaccine development. Nature Reviews Immunology. 2 (4), 251-262 (2002).
  7. Iborra, S., Gonzalez-Granado, J. M. In Vitro Differentiation of Naive CD4(+) T Cells: A Tool for Understanding the Development of Atherosclerosis. Methods in Molecular Biology. 1339, 177-189 (2015).
  8. Toribio-Fernandez, R., et al. Lamin A/C augments Th1 differentiation and response against vaccinia virus and Leishmania major. Cell Death & Disease. 9 (1), 9 (2018).
  9. Lee, T., Shevchenko, I., Sprouse, M. L., Bettini, M., Bettini, M. L. Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice. Journal of Visualized Experiments. (113), (2016).
  10. Cruz-Adalia, A., et al. Conventional CD4(+) T cells present bacterial antigens to induce cytotoxic and memory CD8(+) T cell responses. Nature Communications. 8 (1), 1591 (2017).
  11. Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. The use of fluorescent target arrays for assessment of T cell responses in vivo. Journal of Visualized Experiments. (88), e51627 (2014).
  12. Cruz-Adalia, A., Ramirez-Santiago, G., Torres-Torresano, M., Garcia-Ferreras, R., Veiga Chacon, E. T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells. Journal of Visualized Experiments. (107), e52976 (2016).
  13. Cossarizza, A., et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies. European Journal of Immunology. 47 (10), 1584-1797 (2017).
  14. Quah, B. J., Parish, C. R. New and improved methods for measuring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo using CFSE-like fluorescent dyes. Journal of Immunological Methods. 379 (1-2), 1-14 (2012).
  15. Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice. Lab Animals (NY). 40 (5), 155-160 (2011).
  16. Warth, S. C., Heissmeyer, V. Adenoviral transduction of naive CD4 T cells to study Treg differentiation. Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).
  17. Liou, H. L., Myers, J. T., Barkauskas, D. S., Huang, A. Y. Intravital imaging of the mouse popliteal lymph node. Journal of Visualized Experiments. (60), (2012).

Tags

इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक १३८ इम्यूनोलॉजी CD4 टी सेल टी सेल सक्रियण टी सेल प्रसार टी सेल विभेद अस्थि मज्जा-व्युत्पंन वृक्ष कोशिकाओं दत्तक सेल स्थानांतरण माउस अस्थि मज्जा विभेद OTII चुंबकीय कोशिका अलगाव
एक <em>Vivo</em> माउस मॉडल में भोली CD4 टी सेल सक्रियण, प्रसार और Th1 अस्थि मज्जा द्वारा प्रेरित भेदभाव-व्युत्पंन वृक्ष कोशिकाओं को मापने के लिए
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Toribio-Fernandez, R., Zorita, V.,… More

Toribio-Fernandez, R., Zorita, V., Herrero-Fernandez, B., Gonzalez-Granado, J. M. An In Vivo Mouse Model to Measure Naïve CD4 T Cell Activation, Proliferation and Th1 Differentiation Induced by Bone Marrow-derived Dendritic Cells. J. Vis. Exp. (138), e58118, doi:10.3791/58118 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter