Kynurenine और Kynurenic एसिड का एक उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी माप: अनुभूति और चूहों में सोने के लिए जैव रसायन से संबंधित
Summary
kynurenine मार्ग (केपी) में परिवर्तन neuroactive चयापचयों को मनोरोगी बीमारियों में फंसा रहे हैं. कुतर में vivo में एक बदल kynurenine मार्ग चयापचय के कार्यात्मक परिणामों की जांच स्पष्ट उपंयास चिकित्सीय दृष्टिकोण में मदद मिल सकती है । वर्तमान प्रोटोकॉल जैव रासायनिक और व्यवहार दृष्टिकोण को जोड़ती है चूहों में एक तीव्र kynurenine चुनौती के प्रभाव की जांच ।
Abstract
tryptophan क्षरण के kynurenine मार्ग (केपी) को मनोरोग विकारों में फंसाया गया है. विशेष रूप से, astrocyte-व्युत्पंन metabolite kynurenic एसिड (KYNA), दोनों एनमिथाइल-डी-aspartate (मोर्फिन) और α7 कोर्टेक्स acetylcholine (α7nACh) रिसेप्टर्स में एक विरोधी, स्वास्थ्य और रोग में संज्ञानात्मक प्रक्रियाओं में फंसाया गया है । के रूप में KYNA का स्तर एक प्रकार का पागलपन के साथ रोगियों के दिमाग में बुलंद कर रहे हैं, glutamatergic और कोलीनर्जिक रिसेप्टर्स पर एक खराबी के कारण संज्ञानात्मक रोग, बीमारी के psychopathology के एक कोर डोमेन से संबंधित होने के लिए माना जाता है. KYNA एक प्रकार का पागलपन के साथ व्यक्तियों में pathophysiologically महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकता है । यह प्रत्यक्ष bioprecursor kynurenine के साथ पशुओं के इलाज के द्वारा कुतर मस्तिष्क में अंतर्जात KYNA तरक्की संभव है, और चूहों में नैदानिक अध्ययन है कि KYNA में तीव्र उंनयन उनके सीखने और स्मृति प्रक्रियाओं को प्रभावित कर सकते है दिखा दिया है । वर्तमान प्रोटोकॉल विस्तार में इस प्रायोगिक दृष्टिकोण का वर्णन है और एक को जोड़ती है) रक्त kynurenine स्तर और मस्तिष्क KYNA गठन के एक जैव रासायनिक विश्लेषण (उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी का उपयोग कर), ख) जांच करने के लिए व्यवहार परीक्षण हिप्पोकैम्पस-निर्भर प्रासंगिक स्मृति (निष्क्रिय परिहार प्रतिमान), और ग) सो-जागो व्यवहार का एक आकलन [telemetric रिकॉर्डिंग इलॅक्ट्रोसेफेलॉग्राम (ईईजी) और चूहों में electromyogram (ईएमजी) संकेतों] संयोजन । एक साथ लिया, ऊंचा KYNA, नींद के बीच एक रिश्ता है, और अनुभूति का अध्ययन किया है, और इस प्रोटोकॉल विस्तार में एक प्रयोगात्मक दृष्टिकोण kynurenine उंनयन और चूहों में vivo में KYNA गठन के समारोह परिणामों को समझने के लिए वर्णन करता है । इस प्रोटोकॉल के रूपांतरों के माध्यम से प्राप्त परिणाम परिकल्पना का परीक्षण करेंगे कि केपी और KYNA स्वास्थ्य और रोग राज्यों में नींद और अनुभूति का नियमन करने में निर्णायक भूमिकाएं निभाते हैं ।
Introduction
केपी आवश्यक एमिनो एसिड tryptophan1के लगभग ९५% अपमानजनक के लिए जिंमेदार है । स्तनधारी मस्तिष्क में, astrocytes में लिया kynurenine neuroactive छोटे अणु KYNA में मुख्य रूप से एंजाइम kynurenine aminotransferase (कैट) द्वितीय2द्वारा metabolized है । KYNA मस्तिष्क2,3,4में मोर्फिन और α7nACh रिसेप्टर्स में एक विरोधी के रूप में कार्य करता है, और भी aryl हाइड्रोकार्बन रिसेप्टर (AHR) और जी-प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर ३५ (GPR35) 5 सहित रिसेप्टर्स संकेतन लक्ष्य ,6. प्रयोगात्मक जानवरों में, मस्तिष्क KYNA में उन्नयन व्यवहार परख2,7,8,9,10 की एक सरणी में उनके संज्ञानात्मक प्रदर्शन ख़राब करने के लिए दिखाया गया है . एक उभरती हुई परिकल्पना से पता चलता है कि KYNA नींद-जागो व्यवहार11प्रभावित द्वारा संज्ञानात्मक कार्यों को नियमन करने में एक अभिंन भूमिका निभाता है, इस प्रकार आगे सोने की तंत्रिका जीव विज्ञान नियमन में astrocyte-व्युत्पंन अणुओं की भूमिका का समर्थन और अनुभूति१२.
चिकित्सकीय, KYNA में उन्नयन मस्तिष्कमेरु द्रव और एक प्रकार का पागलपन के साथ रोगियों से पोस्टमार्टम मस्तिष्क ऊतक में पाया गया है13,14,15,16, एक दुर्बल मनोरोग विकार संज्ञानात्मक विकलांगता की विशेषता । एक प्रकार का पागलपन के साथ रोगियों को भी अक्सर नींद अशांति है कि17बीमारी ख़राब कर सकते से त्रस्त हैं । विशेष रूप से सीखने और स्मृति के बीच नींद और अनुभूति, के बीच एक रिश्ता मॉडुलन में केपी चयापचय और KYNA की भूमिका को समझना, एक प्रकार का पागलपन और अन्य में इन गरीब परिणामों के इलाज के लिए उपन्यास चिकित्सा के विकास के लिए नेतृत्व कर सकते हैं मनोरोग बीमारियों ।
केपी चयापचयों के माप के लिए एक विश्वसनीय और सुसंगत विधि से यह विश्वास दिलाना जरूरी है कि विभिन्ना संस्थाओं से उभरते हुए शोध को केपी बायोलॉजी की वैज्ञानिक समझ में एकीकृत किया जा सकता है. वर्तमान में, हम उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (HPLC) द्वारा चूहे के मस्तिष्क में चूहे प्लाज्मा और KYNA में kynurenine को मापने के लिए पद्धति का वर्णन । वर्तमान प्रोटोकॉल, जो Zn 2 की उपस्थिति में एक fluorimetric का पता लगाने का उपयोग करता है+, पहली शिबाता द्वारा विकसित किया गया था18 और अधिक हाल ही में अनुकूलित और पोस्ट के रूप में ५०० mM जस्ता एसीटेट के साथ derivatize के लिए अनुकूलित-कॉलम रिएजेंट, के लिए अनुमति अंतर्जात का पता लगाने, मस्तिष्क में KYNA की nanomolar मात्रा11.
वर्तमान प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में डी नोवो अंतर्जात KYNA उत्पादन को उत्तेजित करने के लिए, प्रत्यक्ष bioprecursor kynurenine चूहों में intraperitoneally (आईएफसआई) इंजेक्ट किया जाता है । KYNA उत्पादन की डिग्री निर्धारित करने के लिए जैव रासायनिक आकलन के साथ संयोजन में, हिप्पोकैम्पस पर निर्भर स्मृति पर एक kynurenine चुनौती के प्रभावों (निष्क्रिय परिहार प्रतिमान) और सो-जागो वास्तुकला (ईईजी और ईएमजी संकेतों) भी है 11की जांच की । इन तकनीकों का एक संयोजन एक kynurenine चुनौती के जैव रासायनिक और कार्यात्मक चूहों में vivo में प्रभाव के अध्ययन के लिए अनुमति देता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
एक परिधीय kynurenine प्रशासन के बाद मस्तिष्क में KYNA के एक विश्वसनीय आकलन के लिए, यह गठबंधन और जैव रासायनिक और कार्यात्मक प्रयोगों की व्याख्या करने के लिए महत्वपूर्ण है. यहाँ, हम एक विस्तृत प्रोटोकॉल है कि नए उप…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
वर्तमान अध्ययन के हिस्से में स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों (R01 NS102209) और क्लेयर ई. फोर्ब्स ट्रस्ट से एक दान द्वारा वित्त पोषित किया गया ।
Materials
| Wistar rats | Charles River Laboratories | adult male, 250-350 g | |
| L-kynurenine sulfate | Sai Advantium | ||
| ReproSil-Pur C18 column (4 x 150 mm) | Dr. Maisch GmbH | ||
| EZ Clips | Stoelting Co. | 59022 | |
| Mounting materials screws | PlasticsOne | 00-96 X 1/16 | |
| Nonabsorbable Sutures | MedRep Express | 699B | CP Medical Monomid Black Nylon Sutures, 4-0, P-3, 18", BOX of 12 |
| Absorbable Sutures | Ethicon | J310H | 4-0 Coated Vicryl Violet 1X27'' SH-1 |
| Dental Cement | Stoelting Co. | 51458 | |
| Drill Bit | Stoelting Co. | 514551 | 0.45 mm |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alliance HPLC system | |||
| E2695 separation module | Waters | 176269503 | |
| 2475 fluorescence detector | Waters | 186247500 | |
| post-column reagent manager | Waters | 725000556 | |
| Lenovo computer | Waters | 668000249 | |
| Empower software | Waters | 176706100 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Passive avoidance box for rat | |||
| Extra tall MDF sound attenuating cubicle | MedAssociates | ENV-018MD | Interior: 22"W x 22"H x 16"D |
| Center channel modulator shuttle box chamber | MedAssociates | ENV-010MC | |
| Stainless steel grid floor for rat | MedAssociates | ENV-010MB-GF | |
| Auto guillotine door | MedAssociates | ENV-010B-S | |
| Quick disconnect shuttle grid floor harness for rat | MedAssociates | ENV-010MB-QD | |
| Stimulus light, 1" white lens, mounted on modular panel | MedAssociates | ENV-221M | |
| Sonalert module with volume control for rat chamber | MedAssociates | ENV-223AM | |
| SmartCtrl 8 input/16 output package | MedAssociates | DIG-716P2 | |
| 8 Channel IR control for shuttle boxes | MedAssociates | ENV-253C | |
| Infrared source and dectector array strips | MedAssociates | ENV-256 | |
| Tabletop interface cabinet, 120 V 60 Hz | MedAssociates | SG-6080C | |
| Dual range constant current aversive stimulation module | MedAssociates | ENV-410B | |
| Solid state grid floor scrambler module | MedAssociates | ENV-412 | |
| Dual A/B shock control module | MedAssociates | ENV-415 | |
| 2' 3-Pin mini-molex extension | MedAssociates | SG-216A-2 | |
| 10' Shock output cable, DB-9 M/F | MedAssociates | SG-219G-10 | |
| Shuttle shock control cable 15', 6 | MedAssociates | SG-219SA | |
| Small tabletop cabinet and power supply, 120 V 60 Hz | MedAssociates | SG-6080D | |
| PCI interface package | MedAssociates | DIG-700P2-R2 | |
| Shuttle box avoidance utility package | MedAssociates | SOF-700RA-7 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sleep-Wake Monitoring Equipment | |||
| Ponehmah software | Data Sciences International (DSI) | PNP-P3P-610 | |
| MX2 8 Source Acquisition interface | Data Sciences International (DSI) | PNM-P3P-MX204 | |
| Dell computer, Optiplex 7020, Windows 7, 64 bit | Data Sciences International (DSI) | 271-0112-013 | |
| Dell 19" computer monitor | Data Sciences International (DSI) | 271-0113-001 | |
| Receivers for plastic cages, 8x | Data Sciences International (DSI) | 272-6001-001 | |
| Cisco RV130 VPN router | Data Sciences International (DSI) | RV130 | |
| Matrix 2.0 | Data Sciences International (DSI) | 271-0119-001 | |
| Network switch | Data Sciences International (DSI) | SG200-08P | |
| Neuroscore software | Data Sciences International (DSI) | 271-0171-CFG | |
| Two biopotential channels transmitter, model TL11M2-F40-EET | Data Sciences International (DSI) | 270-0134-001 |
References
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