Высокая производительность жидкостной хроматографии измерение Кинуренин и Кинуреновая кислота: касающиеся биохимии познания и сна у крыс
Summary
Изменения в нейроактивный метаболитов Кинуренин путь (КП) вовлечены в психиатрических болезней. Расследование функциональные результаты изменены Кинуренин путь метаболизма в естественных условиях в грызунов может помочь прояснить новые терапевтические подходы. Текущий протокол сочетает в себе биохимических и поведенческих подходов для изучения последствий острых Кинуренин вызова крыс.
Abstract
Кинуренин путь (КП) триптофан деградации были причастны психических расстройств. В частности, экзоцитоз производные метаболит Кинуреновая кислота (KYNA), антагонист на обоих N-метил-d-аспартат (NMDA) и рецепторов α7 никотиновых ацетилхолиновых (α7nACh), был вовлечен в когнитивных процессов в здоровье и болезни. Как KYNA уровни повышаются в мозгах пациентов с шизофренией, неисправности на глутаматергические и холинергических рецепторов считается каузально связаны с когнитивной дисфункции, основной домен психопатологии болезни. KYNA могут играть pathophysiologically важную роль в людей с шизофренией. Это позволяет поднять эндогенного KYNA грызунов мозга, лечение животных с прямой bioprecursor Кинуренин, и доклинические исследования на крысах показали, что острый фасады в КИНА могут влиять на процессы обучения и памяти. Текущий протокол описывает этот экспериментальный подход в деталях и сочетает) биохимический анализ крови Кинуренин и мозг формирования КИНА (с помощью высокой производительности жидкостной хроматографии), b) поведенческое тестирование зонда гиппокампа зависимых контекстной памяти (пассивный избежания парадигмы) и c) Оценка поведения сон бодрствование [телеметрической записей, сочетание электроэнцефалограммы (ЭЭГ) и сигналы электромиограммы (ЭМГ)] в крыс. Взятые вместе, изучается связь между повышенной КИНА, сна и познание, и этот протокол описывает подробно экспериментальный подход к пониманию результатов функции высоты Кинуренин и KYNA образование в естественных условиях в крыс. Результаты, полученные через вариации этого протокола будет проверить гипотезу, что КП и KYNA выполнять ключевую роль в модуляции сна и познания в здоровье и болезни Штатах.
Introduction
КП отвечает за унижающего достоинство почти 95% незаменимые аминокислоты триптофан1. В мозге млекопитающих Кинуренин в астроциты метаболизируется в малые молекулы нейроактивный КИНА главным образом фермента Кинуренин (АЛТ) (кат) II2. KYNA действует как антагонист на NMDA и α7nACh рецепторы в мозге2,3,4, и также целей сигнализации рецепторов, включая арил углеводородов рецептор (ААР) и G-белок сочетании рецептор 35 (GPR35)5 ,6. В экспериментальных животных фасады в мозге КИНА показали бы нарушить их когнитивных функций в массив поведенческих анализы2,,78,9,10 . Новые гипотеза предполагает, что КИНА играет важную роль в модуляции когнитивные функции, влияющие на поведение сна11, таким образом дальнейшей поддержки роли экзоцитоз производные молекул в модуляции нейробиологии сна и Познание12.
Клинически фасады в KYNA были найдены в спинномозговой жидкости и посмертные мозговой ткани от пациентов с шизофренией13,14,,1516, изнурительных психическое расстройство характеризуется когнитивные расстройства. Пациентов с шизофренией также часто страдают от расстройства сна, которые могут усугубить болезнь17. Понимание роли КП метаболизма и KYNA в модуляции отношения между сна и познания, особенно между учить и память, могут привести к развитию Роман терапии для лечения этих неблагоприятных исходов в шизофрении и других психические заболевания.
Надежного и последовательного метода для измерения КП метаболитов важно заверить, что исследования, выходящих из различных учреждений могут быть интегрированы в научное понимание биологии КП. В настоящее время мы описываем методологии оценки Кинуренин в плазме крови крыс и KYNA в мозге крыс высокопроизводительных жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Настоящий Протокол, который делает использование обнаружения Флуориметрическое присутствии Zn2 +, был впервые разработан Сибата18 и более недавно адаптирована и оптимизирована для derivatize с 500 мм ацетат цинка как реагент после столбца, позволяющие Обнаружение эндогенные, наномолярных количество КИНА в мозг11.
Чтобы стимулировать выработку эндогенного KYNA de novo , как описано в настоящем Протоколе, прямой bioprecursor Кинуренин вводили внутрибрюшинно (и.п.) у крыс. В сочетании с биохимической оценки для определения степени KYNA производства воздействия Кинуренин вызов памяти гиппокампа зависимые (пассивный избежания парадигмы) и архитектура сон бодрствование (сигналы ЭЭГ и ЭМГ) также исследованы11. Сочетание этих методов позволяет для исследования биохимических и функциональных последствий Кинуренин вызов в естественных условиях в крыс.
Protocol
Representative Results
Discussion
Для надежной оценки КИНА в мозге после периферических Кинуренин администрации важно сочетать и интерпретировать биохимических и функциональных экспериментов. Здесь мы представляем подробный протокол, который позволяет новым пользователям устанавливать эффективные методы для изме?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Настоящее исследование было частично финансируется национальных институтов здравоохранения (R01 NS102209) и пожертвование от Клэр E. Форбс доверять.
Materials
| Wistar rats | Charles River Laboratories | adult male, 250-350 g | |
| L-kynurenine sulfate | Sai Advantium | ||
| ReproSil-Pur C18 column (4 x 150 mm) | Dr. Maisch GmbH | ||
| EZ Clips | Stoelting Co. | 59022 | |
| Mounting materials screws | PlasticsOne | 00-96 X 1/16 | |
| Nonabsorbable Sutures | MedRep Express | 699B | CP Medical Monomid Black Nylon Sutures, 4-0, P-3, 18", BOX of 12 |
| Absorbable Sutures | Ethicon | J310H | 4-0 Coated Vicryl Violet 1X27'' SH-1 |
| Dental Cement | Stoelting Co. | 51458 | |
| Drill Bit | Stoelting Co. | 514551 | 0.45 mm |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alliance HPLC system | |||
| E2695 separation module | Waters | 176269503 | |
| 2475 fluorescence detector | Waters | 186247500 | |
| post-column reagent manager | Waters | 725000556 | |
| Lenovo computer | Waters | 668000249 | |
| Empower software | Waters | 176706100 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Passive avoidance box for rat | |||
| Extra tall MDF sound attenuating cubicle | MedAssociates | ENV-018MD | Interior: 22"W x 22"H x 16"D |
| Center channel modulator shuttle box chamber | MedAssociates | ENV-010MC | |
| Stainless steel grid floor for rat | MedAssociates | ENV-010MB-GF | |
| Auto guillotine door | MedAssociates | ENV-010B-S | |
| Quick disconnect shuttle grid floor harness for rat | MedAssociates | ENV-010MB-QD | |
| Stimulus light, 1" white lens, mounted on modular panel | MedAssociates | ENV-221M | |
| Sonalert module with volume control for rat chamber | MedAssociates | ENV-223AM | |
| SmartCtrl 8 input/16 output package | MedAssociates | DIG-716P2 | |
| 8 Channel IR control for shuttle boxes | MedAssociates | ENV-253C | |
| Infrared source and dectector array strips | MedAssociates | ENV-256 | |
| Tabletop interface cabinet, 120 V 60 Hz | MedAssociates | SG-6080C | |
| Dual range constant current aversive stimulation module | MedAssociates | ENV-410B | |
| Solid state grid floor scrambler module | MedAssociates | ENV-412 | |
| Dual A/B shock control module | MedAssociates | ENV-415 | |
| 2' 3-Pin mini-molex extension | MedAssociates | SG-216A-2 | |
| 10' Shock output cable, DB-9 M/F | MedAssociates | SG-219G-10 | |
| Shuttle shock control cable 15', 6 | MedAssociates | SG-219SA | |
| Small tabletop cabinet and power supply, 120 V 60 Hz | MedAssociates | SG-6080D | |
| PCI interface package | MedAssociates | DIG-700P2-R2 | |
| Shuttle box avoidance utility package | MedAssociates | SOF-700RA-7 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sleep-Wake Monitoring Equipment | |||
| Ponehmah software | Data Sciences International (DSI) | PNP-P3P-610 | |
| MX2 8 Source Acquisition interface | Data Sciences International (DSI) | PNM-P3P-MX204 | |
| Dell computer, Optiplex 7020, Windows 7, 64 bit | Data Sciences International (DSI) | 271-0112-013 | |
| Dell 19" computer monitor | Data Sciences International (DSI) | 271-0113-001 | |
| Receivers for plastic cages, 8x | Data Sciences International (DSI) | 272-6001-001 | |
| Cisco RV130 VPN router | Data Sciences International (DSI) | RV130 | |
| Matrix 2.0 | Data Sciences International (DSI) | 271-0119-001 | |
| Network switch | Data Sciences International (DSI) | SG200-08P | |
| Neuroscore software | Data Sciences International (DSI) | 271-0171-CFG | |
| Two biopotential channels transmitter, model TL11M2-F40-EET | Data Sciences International (DSI) | 270-0134-001 |
References
- Leklem, J. E. Quantitative aspects of tryptophan metabolism in humans and other species: a review. The American Journal of Clinical Nutrition. 24 (6), 659-672 (1971).
- Pocivavsek, A., Notarangelo, F. M., Wu, H. Q., Bruno, J. P., Schwarcz, R., Pletnikov, M. V., Waddington, J. L. Astrocytes as Pharmacological Targets in the Treatment of Schizophrenia: Focus on Kynurenic Acid. Modeling the Psychophathological Dimensions of Schizophrenia – From Molecules to Behavior. , 423-443 (2016).
- Hilmas, C., et al. The brain metabolite kynurenic acid inhibits alpha7 nicotinic receptor activity and increases non-alpha7 nicotinic receptor expression: physiopathological implications. Journal of Neuroscience. 21 (19), 7463-7473 (2001).
- Perkins, M. N., Stone, T. W. An iontophoretic investigation of the actions of convulsant kynurenines and their interaction with the endogenous excitant quinolinic acid. Brain Research. 247 (1), 184-187 (1982).
- DiNatale, B. C., et al. Kynurenic acid is a potent endogenous aryl hydrocarbon receptor ligand that synergistically induces interleukin-6 in the presence of inflammatory signaling. Toxicological Sciences. 115 (1), 89-97 (2010).
- Wang, J., et al. Kynurenic acid as a ligand for orphan G protein-coupled receptor GPR35. The Journal of Biological Chemistry. 281 (31), 22021-22028 (2006).
- Alexander, K. S., Wu, H. Q., Schwarcz, R., Bruno, J. P. Acute elevations of brain kynurenic acid impair cognitive flexibility: normalization by the alpha7 positive modulator galantamine. Psychopharmacology (Berlin). 220 (3), 627-637 (2012).
- Chess, A. C., Landers, A. M., Bucci, D. J. L-kynurenine treatment alters contextual fear conditioning and context discrimination but not cue-specific fear conditioning. Behavioural Brain Research. 201 (2), 325-331 (2009).
- Chess, A. C., Simoni, M. K., Alling, T. E., Bucci, D. J. Elevations of endogenous kynurenic acid produce spatial working memory deficits. Schizophrenia Bulletin. 33 (3), 797-804 (2007).
- Pocivavsek, A., et al. Fluctuations in endogenous kynurenic acid control hippocampal glutamate and memory. Neuropsychopharmacology. 36 (11), 2357-2367 (2011).
- Pocivavsek, A., Baratta, A. M., Mong, J. A., Viechweg, S. S. Acute Kynurenine Challenge Disrupts Sleep-Wake Architecture and Impairs Contextual Memory in Adult Rats. Sleep. 40 (11), (2017).
- Halassa, M. M., et al. Astrocytic modulation of sleep homeostasis and cognitive consequences of sleep loss. Neuron. 61 (2), 213-219 (2009).
- Erhardt, S., et al. Kynurenic acid levels are elevated in the cerebrospinal fluid of patients with schizophrenia. Neuroscience Letters. 313 (1-2), 96-98 (2001).
- Linderholm, K. R., et al. Increased levels of kynurenine and kynurenic acid in the CSF of patients with schizophrenia. Schizophrenia Bulletin. 38 (3), 426-432 (2012).
- Sathyasaikumar, K. V., et al. Impaired kynurenine pathway metabolism in the prefrontal cortex of individuals with schizophrenia. Schizophrenia Bulletin. 37 (6), 1147-1156 (2011).
- Schwarcz, R., et al. Increased cortical kynurenate content in schizophrenia. Biological Psychiatry. 50 (7), 521-530 (2001).
- Pocivavsek, A., Rowland, L. M. Basic Neuroscience Illuminates Causal Relationship Between Sleep and Memory: Translating to Schizophrenia. Schizophrenia Bulletin. 44 (1), 7-14 (2018).
- Shibata, K. Fluorimetric micro-determination of kynurenic acid, an endogenous blocker of neurotoxicity, by high-performance liquid chromatography. Journal of Chromatography. 430 (2), 376-380 (1988).
- Buzsaki, G. Memory consolidation during sleep: a neurophysiological perspective. Journal of Sleep Research. 7, 17-23 (1998).
- Graves, L. A., Heller, E. A., Pack, A. I., Abel, T. Sleep deprivation selectively impairs memory consolidation for contextual fear conditioning. Learning & Memory. 10 (3), 168-176 (2003).
- Yamashita, M., Yamamoto, T. Tryptophan circuit in fatigue: From blood to brain and cognition. Brain Research. 1675, 116-126 (2017).
