Förändringar i kynurenine väg (KP) neuroactive metaboliterna är inblandade i psykiatriska illnesses. Undersöka de funktionella resultaten av en förändrad kynurenine väg metabolism i vivo hos gnagare kan bidra till att belysa nya terapeutiska metoder. Det nuvarande protokollet kombinerar biokemiska och beteendevetenskapliga metoder för att undersöka effekterna av en akut kynurenine utmaning hos råttor.
Kynurenine vägen (KP) av tryptofan nedbrytning har varit inblandad i psykiska störningar. Specifikt, i Astrocyten-derived metaboliten kynurensyra (Kynurensyra), en antagonist till både N-metyl-d-aspartat (NMDA) och α7 (α7nACh) nikotinacetylkolinreceptorer, har varit inblandad i kognitiva processer i hälsa och sjukdom. Som Kynurensyra-nivåerna är förhöjda i hjärnan hos patienter med schizofreni, tros fel på den glutamaterga och kolinerga receptorer vara kausalt relaterade till kognitiv dysfunktion, en core-domän av psychopathology av sjukan. Kynurensyra kan spela en pathophysiologically betydande roll hos personer med schizofreni. Det är möjligt att höja endogen Kynurensyra i gnagare hjärnan genom att behandla djuren med den direkta bioprecursor kynurenine och prekliniska studier på råttor har visat att akut förhöjningar av Kynurensyra kan påverka deras inlärning och minne processer. Det nuvarande protokollet beskriver detta experimentella tillvägagångssätt i detalj och kombinerar en) en biokemisk analys av blodfetter kynurenine och hjärnans Kynurensyra bildandet (med högpresterande vätskekromatografi), b) beteendemässiga testning för att undersöka den Hippocampus-beroende kontextuella minne (passivt undvikande paradigm) och c) en bedömning av sömn-vakna beteende [telemetriska inspelningar att kombinera elektroencefalogram (EEG) och Elektromyogram (EMG) signaler] hos råttor. Sammantaget en relation mellan förhöjda Kynurensyra, sömn och kognition studeras, och det här protokollet beskriver i detalj ett experimentellt förhållande till förstå funktionen resultat i kynurenine höjd och Kynurensyra bildandet i vivo på råtta. Resultat som erhållits genom variationer i detta protokoll kommer att testa hypotesen att de KP och Kynurensyra tjäna avgörande roller i modulerande sömn och kognition i hälsa och sjukdom.
KPEN ansvarar för förnedrande nästan 95% av den essentiella aminosyra tryptofan1. I däggdjur hjärnan metaboliseras kynurenine beaktas astrocyter in neuroactive små molekylen Kynurensyra primärt av enzymet kynurenine aspartataminotransferas (KAT) II2. Kynurensyra fungerar som en antagonist till NMDA och α7nACh receptorer i hjärnan2,3,4, och också mål signalering receptorer inklusive aryl kolväte receptorn (AHR) och G-protein kopplade receptor 35 (GPR35)5 ,6. Försöksdjur, har förhöjningar i hjärnans Kynurensyra visat sig försämra deras kognitiva prestanda i en matris av beteendemässiga analyser2,7,8,9,10 . En framväxande hypotes antyder att Kynurensyra spelar en viktig roll i modulerande kognitiva funktioner av påverkar sömn-vakna beteende11, således ytterligare stödjande roll Astrocyten framställda molekyler i modulerande neurobiologin sömn och kognition12.
Kliniskt, har förhöjningar av Kynurensyra hittats i cerebrospinalvätska och post mortem vävnad från patienter med schizofreni13,14,15,16, ett försvagande psykiatrisk sjukdom kännetecknas av nedsatt kognitiv funktion. Patienter med schizofreni är också ofta plågas av sömnstörningar som kan förvärra de sjukdom17. Förstå rollen som KP metabolism och Kynurensyra i modulerande en relation mellan sömn och kognition, särskilt mellan inlärning och minne, kan leda till utvecklingen av nya terapier för behandling av dessa dåliga resultat i schizofreni och andra psykiatriska sjukdomar.
En tillförlitlig och konsekvent metod för mätning av KP metaboliter är viktigt att försäkra att den forskning som framväxande från olika institutioner kan integreras i den vetenskapliga förståelsen av KP biologi. För närvarande, beskriver vi metoden för att mäta kynurenine i råtta plasma och Kynurensyra i råtthjärna av högpresterande vätskekromatografi (HPLC). Det nuvarande protokollet, som gör användningen av en fluorimetriskt upptäckt i närvaro av Zn2 +, utvecklades först av Shibata18 och mer nyligen anpassade och optimerade för att derivatize med 500 mM zinkacetat som efter kolumn reagens, vilket möjliggör Påvisande av endogen, nanomolar mängder Kynurensyra i hjärnan11.
För att stimulera de novo endogen Kynurensyra produktion som beskrivs i detta protokoll, den direkta bioprecursor kynurenine injiceras intraperitonealt (i.p.) hos råttor. I kombination med biokemiska bedömningar för att bestämma graden av Kynurensyra produktion, effekterna av en kynurenine utmana på Hippocampus-beroende minnet (passivt undvikande paradigm) och sömn-vakna arkitekturen (EEG och EMG signaler) är också undersökta11. En kombination av dessa tekniker möjliggör studier av biokemiska och funktionella effekterna av en kynurenine utmaning i vivo på råtta.
För en tillförlitlig bedömning av Kynurensyra i hjärnan efter en perifer kynurenine administration är det viktigt att kombinera och tolka biokemiska och funktionella experiment. Här presenterar vi ett detaljerat protokoll som tillåter nya användare att upprätta effektiva metoder för att mäta plasma kynurenine och hjärnans Kynurensyra hos råttor. Mätning av kynurenine i plasma bekräftade korrekt injektion och mätning av metaboliten Kynurensyra bekräftar de novo syntesen i hjärnan. Det finns fler…
The authors have nothing to disclose.
Den aktuella studien var delvis finansierad av National Institutes of Health (R01 NS102209) och en donation från Clare E. Forbes Trust.
Wistar rats | Charles River Laboratories | adult male, 250-350 g | |
L-kynurenine sulfate | Sai Advantium | ||
ReproSil-Pur C18 column (4 x 150 mm) | Dr. Maisch GmbH | ||
EZ Clips | Stoelting Co. | 59022 | |
Mounting materials screws | PlasticsOne | 00-96 X 1/16 | |
Nonabsorbable Sutures | MedRep Express | 699B | CP Medical Monomid Black Nylon Sutures, 4-0, P-3, 18", BOX of 12 |
Absorbable Sutures | Ethicon | J310H | 4-0 Coated Vicryl Violet 1X27'' SH-1 |
Dental Cement | Stoelting Co. | 51458 | |
Drill Bit | Stoelting Co. | 514551 | 0.45 mm |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Alliance HPLC system | |||
E2695 separation module | Waters | 176269503 | |
2475 fluorescence detector | Waters | 186247500 | |
post-column reagent manager | Waters | 725000556 | |
Lenovo computer | Waters | 668000249 | |
Empower software | Waters | 176706100 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Passive avoidance box for rat | |||
Extra tall MDF sound attenuating cubicle | MedAssociates | ENV-018MD | Interior: 22"W x 22"H x 16"D |
Center channel modulator shuttle box chamber | MedAssociates | ENV-010MC | |
Stainless steel grid floor for rat | MedAssociates | ENV-010MB-GF | |
Auto guillotine door | MedAssociates | ENV-010B-S | |
Quick disconnect shuttle grid floor harness for rat | MedAssociates | ENV-010MB-QD | |
Stimulus light, 1" white lens, mounted on modular panel | MedAssociates | ENV-221M | |
Sonalert module with volume control for rat chamber | MedAssociates | ENV-223AM | |
SmartCtrl 8 input/16 output package | MedAssociates | DIG-716P2 | |
8 Channel IR control for shuttle boxes | MedAssociates | ENV-253C | |
Infrared source and dectector array strips | MedAssociates | ENV-256 | |
Tabletop interface cabinet, 120 V 60 Hz | MedAssociates | SG-6080C | |
Dual range constant current aversive stimulation module | MedAssociates | ENV-410B | |
Solid state grid floor scrambler module | MedAssociates | ENV-412 | |
Dual A/B shock control module | MedAssociates | ENV-415 | |
2' 3-Pin mini-molex extension | MedAssociates | SG-216A-2 | |
10' Shock output cable, DB-9 M/F | MedAssociates | SG-219G-10 | |
Shuttle shock control cable 15', 6 | MedAssociates | SG-219SA | |
Small tabletop cabinet and power supply, 120 V 60 Hz | MedAssociates | SG-6080D | |
PCI interface package | MedAssociates | DIG-700P2-R2 | |
Shuttle box avoidance utility package | MedAssociates | SOF-700RA-7 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Sleep-Wake Monitoring Equipment | |||
Ponehmah software | Data Sciences International (DSI) | PNP-P3P-610 | |
MX2 8 Source Acquisition interface | Data Sciences International (DSI) | PNM-P3P-MX204 | |
Dell computer, Optiplex 7020, Windows 7, 64 bit | Data Sciences International (DSI) | 271-0112-013 | |
Dell 19" computer monitor | Data Sciences International (DSI) | 271-0113-001 | |
Receivers for plastic cages, 8x | Data Sciences International (DSI) | 272-6001-001 | |
Cisco RV130 VPN router | Data Sciences International (DSI) | RV130 | |
Matrix 2.0 | Data Sciences International (DSI) | 271-0119-001 | |
Network switch | Data Sciences International (DSI) | SG200-08P | |
Neuroscore software | Data Sciences International (DSI) | 271-0171-CFG | |
Two biopotential channels transmitter, model TL11M2-F40-EET | Data Sciences International (DSI) | 270-0134-001 |