Summary

Kynurenine 및 Kynurenic 산의 고성능 액체 크로마토그래피 측정: 생화학 인식 및 쥐에 수 면에 관한

Published: August 19, 2018
doi:

Summary

Kynurenine 통로 (KP) neuroactive metabolites 변경 정신 질병에 연루 됩니다. 변경 된 kynurenine 통로 신진 대사에서 vivo에서 설치류에서의 기능적인 결과 조사 하 고 새로운 치료 접근을 명료 하 게 하는 것을 도울 수 있다. 현재 프로토콜 쥐에 심각한 kynurenine 도전의 영향을 조사 하기 위해 생 화 학적 및 행동 접근을 결합 합니다.

Abstract

트립토판 저하의 kynurenine 통로 (KP) 정신 장애에 연루 되었습니다. 특히, 사이토 파생 된 대사 산물 kynurenic 산 (KYNA), 두 N에 적-메 틸-d-aspartate (NMDA)와 α7 nicotinic 아 세 틸 콜린 (α7nACh) 수용 체, 건강과 질병에 있는 인지 과정에 연루 되어 있다. KYNA 레벨은 정신 분열 증을 가진 환자의 두뇌에서 상승로 glutamatergic 및 해 수용 체에서 오작동 인지 기능 장애, 질병의 병리학의 핵심 도메인 관련 원인이 될 여겨진다. KYNA는 정신 분열 증을 가진 개인에서 pathophysiologically 중요 한 역할을 재생할 수 있습니다. 그것은 직접 bioprecursor kynurenine와 동물을 치료 하 여 설치류 두뇌에 내 인 성 KYNA 상승 수 그리고 쥐에 전 임상 연구는 급성 고도 KYNA에 그들의 학습 및 메모리 프로세스 영향을 미칠 수 증명. 현재 프로토콜이 실험 방법을 자세히 설명 하 고 혈액 kynurenine 수준 및 뇌 KYNA 형성 (를 사용 하 여 고성능 액체 크로마토그래피), a)는 생 화 확 적인 분석을 결합 하 여 b) 행동 테스트를 조사 하는 hippocampal 종속 컨텍스트 메모리 (수동 회피 패러다임), 그리고 c) 수 면-각 성 행동 [뇌 파 (EEG)와 치십시오 (EMG) 신호를 결합 하는 telemetric 녹음]의 평가 쥐에서. 함께 찍은, 높은 KYNA, 수 면, 그리고 인식 사이의 관계를 공부 했다, 그리고이 프로토콜 kynurenine 상승 및 KYNA 형성에서 vivo에서 쥐에서의 함수 결과 이해 하는 실험적인 접근 방식을 자세하게에서 설명 합니다. 이 프로토콜의 변화를 통해 얻은 결과 KP와 KYNA 수 면과 건강 및 질병 상태에서 인식 변조에 중추적인 역할을 봉사 하는 가설을 테스트 합니다.

Introduction

KP는 필수 아미노산 트립토판1의 거의 95% 저하 합니다. 포유류 두뇌에서 kynurenine 이다로 효소 kynurenine aminotransferase (KAT) II2로 주로 neuroactive 작은 분자 KYNA에 대사입니다. KYNA 뇌2,3,4, α7nACh와 NMDA 수용 체에 길 항 근으로 작동 하 고 또한 대상 aryl 탄화수소 수용 체 (a h R) 등 G-단백질 수용 체 신호 결합 수용 체 35 (GPR35)5 ,6. 실험 동물에서 뇌 KYNA 고도 행동 분석 실험2,7,8,,910 의 그들의 인지에 관한 퍼포먼스를 손상 표시 되었습니다. . 신흥 가설 제안 KYNA 따라서 변조 수 면의 신경 생물학에서에 더 사이토 파생 분자의 역할을 지 원하는 수 면-각 성 동작11, 영향에 의해 인지 기능 조절에 필수적인 역할 재생 및 인식12.

임상, KYNA 고도 발견 되었습니다 척수 및 사후 뇌 조직에서 정신 분열 증13,,1415,16, 쇠 약 정신 장애를 가진 환자에서 인지 장애가 특징. 정신 분열 증 환자는 또한 종종 병17을 악화 수 있습니다 수 면 방해에 의해 괴 롭 혀. 이 불 쌍 한 결과 정신 분열 증 및 다른 치료에 대 한 새로운 치료의 발전으로 이어질 수 있습니다 변조 수 면과 인식, 학습 및 메모리, 사이 특히 관계에 KP 신진 대사와 KYNA의 역할을 이해 정신과 질병

KP 대사 산물의 측정에 대 한 안정적이 고 일관 된 방법을 다양 한 기관에서 신흥 연구 KP 생물학의 과학적 이해에 통합 될 수을 보장 하기 위해서 중요 하다. 현재, 우리는 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)에 의해 쥐 플라스마에서 kynurenine 및 쥐 두뇌에 있는 KYNA를 측정 하는 방법론을 설명 합니다. 현재 프로토콜을 만드는 존재 Zn2 +fluorimetric 검색의 사용, 시바타18 등 최근 적응 하 고 허용 후 열 시 약으로 500 m m 아연 아세테이트와 derivatize을 최적화 된에 의해 처음 개발 되었다 생, nanomolar 양의 KYNA 뇌11탐지 합니다.

현재 프로토콜에 설명 된 대로 드 노 보 생 KYNA 생산을 자극, 직접적인 bioprecursor kynurenine intraperitoneally 주입 (i.p.) 쥐에서. KYNA 생산의 정도 확인 하는 생 화 확 적인 평가 함께, hippocampal 종속 메모리 (수동 회피 패러다임)에 도전 하는 kynurenine의 영향 및 수 면-각 성 건축 (EEG 및 EMG 신호) 이기도 조사11. 이러한 기술 조합은 kynurenine 도전에서 vivo에서 쥐에서의 생 화 학적 및 기능적 영향의 연구에 대 한 수 있습니다.

Protocol

우리의 실험 프로토콜 메릴랜드 대학 제도 동물 보호와 사용 위원회에 의해 승인 하 고 관리 및 실험 동물의 사용에 대 한에 국립 보건원의 가이드를 따 랐. 참고: 성인 남성 Wistar 쥐 (250-350 g)는 모든 실험에 사용 되었다. 별도 동료 동물의 생 화 확 적인 분석, 행동 실험, 그리고 수 면-각 성 녹음 사용 되었다. 동물은 메릴랜드 정신 연구 센터에서 온도 제어 시설에 보관 되어 있…

Representative Results

KYNA 뇌를 높이 방법으로 복 kynurenine 주사를 사용 하 여 유효성을 검사 하려면 조직의 HPLC 분석 수행 되었다. 표준 곡선 (그림 1) 관련된 소프트웨어를 사용 하 고 조직 샘플의 정량화에 대 한 허용에 건설 되었다. Kynurenine 및 KYNA에 대 한 대표 chromatograms는 그림 2에 표시 됩니다. Kynurenine 6 분의 보존 기간에 관찰 되었다 그리고 KYNA 11…

Discussion

주변 kynurenine 관리 후 두뇌에 있는 KYNA의 신뢰할 수 있는 평가, 결합 하 고 생 화 학적 및 기능 실험 해석 중요 하다. 여기, 우리는 새로운 사용자가 플라즈마 kynurenine 및 KYNA 쥐의 뇌를 측정 하기 위한 효과적인 방법을 설정 하도록 허용 하는 상세한 프로토콜 제시. 플라스마에 kynurenine의 측정 확인 정확한 주입 및 KYNA 대사 산물의 측정 확인 두뇌에 de novo 종합. 설명된 fluorometric HPLC 방법에 맞?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

현재 학문 건강의 국가 학회 (R01 NS102209)와 클레어 E. 포브스 신뢰에서 기부금에 의해 부분적으로 투자 되었다.

Materials

Wistar rats Charles River Laboratories adult male, 250-350 g
L-kynurenine sulfate Sai Advantium
ReproSil-Pur C18 column (4 x 150 mm) Dr. Maisch GmbH
EZ Clips Stoelting Co. 59022
Mounting materials screws PlasticsOne 00-96 X 1/16
Nonabsorbable Sutures MedRep Express 699B CP Medical Monomid Black Nylon Sutures, 4-0, P-3, 18", BOX of 12
Absorbable Sutures Ethicon J310H 4-0 Coated Vicryl Violet 1X27'' SH-1
Dental Cement Stoelting Co. 51458
Drill Bit Stoelting Co. 514551 0.45 mm
Name Company Catalog Number Comments
Alliance HPLC system
E2695 separation module Waters 176269503
2475 fluorescence detector Waters 186247500
post-column reagent manager Waters 725000556
Lenovo computer Waters 668000249
Empower software Waters 176706100
Name Company Catalog Number Comments
Passive avoidance box for rat
Extra tall MDF sound attenuating cubicle MedAssociates ENV-018MD Interior: 22"W x 22"H x 16"D
Center channel modulator shuttle box chamber MedAssociates ENV-010MC
Stainless steel grid floor for rat MedAssociates ENV-010MB-GF
Auto guillotine door MedAssociates ENV-010B-S
Quick disconnect shuttle grid floor harness for rat MedAssociates ENV-010MB-QD
Stimulus light, 1" white lens, mounted on modular panel MedAssociates ENV-221M
Sonalert module with volume control for rat chamber MedAssociates ENV-223AM
SmartCtrl 8 input/16 output package MedAssociates DIG-716P2
8 Channel IR control for shuttle boxes MedAssociates ENV-253C
Infrared source and dectector array strips MedAssociates ENV-256
Tabletop interface cabinet, 120 V 60 Hz MedAssociates SG-6080C
Dual range constant current aversive stimulation module MedAssociates ENV-410B
Solid state grid floor scrambler module MedAssociates ENV-412
Dual A/B shock control module MedAssociates ENV-415
2' 3-Pin mini-molex extension MedAssociates SG-216A-2
10' Shock output cable, DB-9 M/F MedAssociates SG-219G-10
Shuttle shock control cable 15', 6 MedAssociates SG-219SA
Small tabletop cabinet and power supply, 120 V 60 Hz MedAssociates SG-6080D
PCI interface package MedAssociates DIG-700P2-R2
Shuttle box avoidance utility package MedAssociates SOF-700RA-7
Name Company Catalog Number Comments
Sleep-Wake Monitoring Equipment
Ponehmah software Data Sciences International (DSI) PNP-P3P-610
MX2 8 Source Acquisition interface Data Sciences International (DSI) PNM-P3P-MX204
Dell computer, Optiplex 7020, Windows 7, 64 bit Data Sciences International (DSI) 271-0112-013
Dell 19" computer monitor Data Sciences International (DSI) 271-0113-001
Receivers for plastic cages, 8x Data Sciences International (DSI) 272-6001-001
Cisco RV130 VPN router Data Sciences International (DSI) RV130
Matrix 2.0 Data Sciences International (DSI) 271-0119-001
Network switch Data Sciences International (DSI) SG200-08P
Neuroscore software Data Sciences International (DSI) 271-0171-CFG
Two biopotential channels transmitter, model TL11M2-F40-EET Data Sciences International (DSI) 270-0134-001

References

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Cite This Article
Baratta, A. M., Viechweg, S. S., Mong, J. A., Pocivavsek, A. A High-performance Liquid Chromatography Measurement of Kynurenine and Kynurenic Acid: Relating Biochemistry to Cognition and Sleep in Rats. J. Vis. Exp. (138), e58129, doi:10.3791/58129 (2018).

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