Ensaio de triagem à base de SA-β-galactosidase para a identificação de medicamentos Senoterapêuticos
Summary
A senescência celular é o fator-chave no desenvolvimento de patologias crônicas relacionadas à idade. A identificação da terapêutica que visam as células senescentes mostra a promessa de estender o envelhecimento saudável. Aqui, nós apresentamos um ensaio novo à tela para a identificação do senotherapeutics baseado na medida da atividade associada da senescência β-galactosidase em únicas pilhas.
Abstract
A senescência celular é uma das marcas de envelhecimento conhecidas por influenciar negativamente uma vida saudável. Drogas capazes de matar células senescentes especificamente na cultura celular, denominado senolíticos, pode reduzir a carga celular senescente in vivo e estender healthspan. Foram identificadas várias classes de senolíticos até à data, incluindo inibidores da HSP90, inibidores da família Bcl-2, piperlongumina, um peptídeo inibitório FOXO4 e a combinação de Dasatinib/quercetina. A detecção de SA-β-GAL em um aumento do pH lisossomal é um dos melhores marcadores caracterizados para a detecção de células senescentes. Medições de células ao vivo de atividade de β-galactosidase (SA-β-GAL) associada à senescência usando o substrato fluorescente C12FDG em combinação com a determinação do número total de células usando um corante de Hoechst de intercalação de DNA abre a possibilidade de tela para medicamentos senoterapêuticos que reduzem a atividade geral de SA-β-GAL por morte de células senescentes (senolíticos) ou suprimindo SA-β-GAL e outros fenótipos de células senescentes (senomorphics). O uso de uma plataforma de aquisição e análise de imagens fluorescentes de alto conteúdo permite a triagem rápida e de alta produtividade de bibliotecas de medicamentos para efeitos em SA-β-GAL, morfologia celular e número de células.
Introduction
A senescência celular foi descrita pela primeira vez por Leonard Hayflick e Paul Moorhead, que mostraram que as células normais tinham uma capacidade limitada de proliferar na cultura1. As células senescentes não proliferam apesar da presença de nutrientes, fatores de crescimento e falta de inibição de contato, mas permanecem metabolicamente ativos2. Esse fenômeno é conhecido como senescência replicativa e foi atribuído principalmente ao encurtamento do telômero, pelo menos nas células humanas3. Estudos adicionais mostraram que as células também podem ser induzidas a sofrer senescência em resposta a outros estímulos, como estresse oncogênico (senescência induzida por oncogenes, OIS), dano de DNA, drogas citotóxicas ou irradiação (senescência induzida por estresse, SIS)4 , 5. º , 6. em resposta a danos de DNA, incluindo a erosão do telômero, células ou senesce, iniciar o crescimento celular descontrolado, ou submeter-se a apoptose se o dano não pode ser reparado. Neste caso, a senescência da pilha parece ser benéfica porque actua em uma maneira supressiva do tumor2. Em contraste, a senescência é aumentada com o envelhecimento devido ao acúmulo de danos celulares, incluindo danos ao DNA. Desde que as pilhas senescentes podem secretar cytokines, metaloproteinases e fatores de crescimento, denominados o phenotype secretora senescência-associado (SASP), este aumento idade-dependente na senescência celular e no SASP contribui à homeostase diminuída do tecido e subsequentemente envelhecimento. Além disso, esse aumento dependente da idade na carga de senescência é conhecido por induzir doenças metabólicas, sensibilidade ao estresse, síndromes de progeria e cicatrização prejudicada7,8 e é, em parte, responsável pelas inúmeras doenças como aterosclerose, osteoartrite, degeneração muscular, formação de úlcera e doença de Alzheimer9,10,11,12,13. Eliminar as células senescentes pode ajudar a prevenir ou atrasar a disfunção tecidual e estender o Califórnia14. Isso tem sido demonstrado em modelos de camundongo transgênico14,15,16, bem como usando drogas senolíticas e combinações de drogas que foram descobertas através de ambos os esforços de triagem de drogas e análise Bioinformatica de vias induzidas especificamente em células senescentes17,18,19,20,21,22. A identificação de medicamentos senoterapêuticos mais ideais, capazes de reduzir de forma mais efetiva a carga celular senescente, é um passo importante no desenvolvimento de abordagens terapêuticas para o envelhecimento saudável.
As pilhas senescent mostram características fenotípicas e moleculars característicos, na cultura e in vivo. Estes marcadores da senescência podiam ser a causa ou o resultado da indução da senescência ou de um subproduto de mudanças moleculars nestas pilhas. No entanto, nenhum único marcador é encontrado especificamente em células senescentes. Atualmente, a detecção de β-galactosidase (SA-β-GAL) associada à senescência é um dos métodos mais caracterizados e estabelecidos com base em uma única célula para medir a senescência in vitro e in vivo. SA-β-GAL é uma hidrolase lisossomal com uma atividade enzimática ótima em pH 4. A mensuração de sua atividade em pH 6 é possível porque as células senescentes apresentam aumento da atividade lisossomal23,24. Para as células vivas, o aumento do pH lisossomal é obtido por alcalinização lisossomal com o inibidor vacuolar H+-ATPase bafilomicina a1 ou o inibidor da acidificação endossômica cloroquina25,26. 5-dodecanoylaminofluorescein di-β-D-galactopyranoside (C12FDG) é usado como substrato em células vivas, pois retém o produto clivada nas células devido à sua 12 fração lipofílica de carbono25. Importante, a atividade do SA-β-GAL própria não é conectada diretamente com nenhum caminho identificado em pilhas senescentes e não é necessário induzir a senescência. Com este ensaio, as células senescentes podem ser identificadas mesmo nas populações de células heterogêneas e nos tecidos de envelhecimento, como biópsias de pele de indivíduos mais velhos. Ele também tem sido usado para mostrar uma correlação entre a senescência celular e envelhecimento23 , pois é um marcador confiável para detecção de células senescentes em vários organismos e condições27,28,29, a 30. Aqui, um ensaio de triagem de SA-β-GAL de alta taxa de transferência baseado no substrato fluorescente C12FDG usando fibroblastos embrionários do mouse primário (mefs) com a senescência de células induzida por estresse oxidativo robusto é descrito e suas vantagens e desvantagens são discutidos. Embora este ensaio possa ser executado com tipos diferentes da pilha, o uso de Ercc1-deficiente, mefs danificado do reparo do ADN permite a indução mais rápida da senescência condições do stress oxidativo. Em camundongos, a expressão reduzida do reparo do DNA endonuclease ERCC1-XPF causa o reparo danificado do ADN, acumulação acelerada de dano endógeno do ADN, ROS elevados, deficiência orgânica mitochondrial, carga senescentes aumentada da pilha, perda da função da pilha de haste e envelhecimento prematuro, semelhante ao envelhecimento natural31,32. Similarmente, os MEFs Ercc1-deficientes submetem-se à senescência mais ràpida na cultura17. Uma característica importante do ensaio senescente de MEF é que cada poço tem uma mistura de células senescentes e não senescentes, permitindo a demonstração clara de efeitos específicos de células senescentes. No entanto, embora acreditemos que o uso de estresse oxidativo nas células primárias para induzir a senescência é mais fisiológico, este ensaio também pode ser usado com linhas celulares onde a senescência é induzida com agentes nocivos do DNA, como etoposide ou irradiação.
Protocol
Representative Results
Discussion
SA-β-GAL é um biomarcador bem definido para a senescência celular originalmente descoberta por Dimri et al. (1995) mostrando que os fibroblastos humanos senescentes aumentaram a atividade da SA-β-GAL quando analisados em pH 623 em comparação com as células proliferantes. Entretanto, os ensaios in vitro e in vivo para SA-β-GAL foram estabelecidos para diferentes tipos de células e tecidos25,39,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo NIH Grants AG043376 (Project 2 e Core A, PDR; Projeto 1 e núcleo B, LJN) e AG056278 (projeto 3 e núcleo A, PDR; e projeto 2, LJN) e uma concessão da Fundação de Glenn (LJN).
Materials
| DMEM | Corning | 10-013-CV | medium |
| Ham's F10 | Gibco | 12390-035 | medium |
| fetal bovine serum | Tissue Culture Biologics | 101 | serum |
| 1x non-essential amino acids | Corning | 25-025-Cl | amino-acids |
| bafilomycin A1 | Sigma | B1793 | lysosomal inhibitor |
| C12FDG | Setareh Biotech | 7188 | b-Gal substrate |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H1399 | DNA intercalation agent |
| 17DMAG | Selleck Chemical LLC | 50843 | HSP90 inhibitor |
| InCell6000 Cell Imaging System | GE Healthcare | High Content Imaging System |
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