SA-β-갈락토시다아제 계 선별 분석법
Summary
세포 노화는 만성 연령 과 관련된 병리 발달의 핵심 요소입니다. 노화 세포를 표적으로 하는 치료제의 식별은 건강한 노화를 연장하기 위한 약속을 보여줍니다. 여기서, 우리는 단일 세포에서 의 노화 관련 β-갈락토시다아제 활성의 측정에 기초하여 senotherapeutics의 식별을 위해 스크리블하는 새로운 분석방법을 제시한다.
Abstract
세포 노화는 건강한 수명에 부정적인 영향을 미치는 것으로 알려진 노화의 특징 중 하나입니다. 세포 배양에서 특히 노화 세포를 죽일 수있는 약물, senolytics라고, 생체 내에서 노화 세포 부담을 감소시키고 건강을 연장 할 수 있습니다. Senolytics의 여러 클래스는 현재까지 HSP90 억제제를 포함 하 여 확인 되었습니다., Bcl-2 가족 억제제, piperlongumine, FOXO4 억제 펩 티 드와 다 사 티 닙/케르세틴의 조합. 증가된 리소좀 pH에서 SA-β-Gal의 검출은 노화 세포의 검출을 위한 최고의 특징 마커 중 하나이다. 노화 관련 β-갈락토시다아제(SA-β-Gal) 활성의 살아있는 세포 측정은 호흐트트 염료를 인터컬레이팅하는 DNA를 이용하여 총 세포 수의 측정과 조합하여 형광 기질 C12FDG를 이용한 가능성을 열어준다. 노화 세포 (senolytics)를 죽이거나 SA-β-Gal 및 노화 세포의 다른 표현형을 억제하여 전반적인 SA-β-Gal 활성을 감소시키는 세포 치료 약물에 대한 스크린 (senomorphics). 높은 함량의 형광 이미지 수집 및 분석 플랫폼을 사용하면 SA-β-Gal, 세포 형태 및 세포 수에 미치는 영향에 대한 약물 라이브러리의 신속하고 높은 처리량 스크리닝이 가능합니다.
Introduction
세포 노화는 레너드 헤이플릭과 폴 무어헤드에 의해 처음으로 기술되었으며, 이들은 정상 세포가 배양1에서 증식하는 능력이 제한적이라는 것을 보여주었다. 노화 세포는 영양소의 존재에도 불구하고 증식하지 못하고, 성장 인자 및 접촉 억제의부족, 그러나 신진 대사 활성 남아 2. 이러한 현상은 복제 노쇠로 알려져 있으며 주로 인간 세포 3에서 텔로미어 단축에기인했다. 추가 연구는 세포가 또한 종양 발생 스트레스 (종양 유전자 유도 노쇠, OIS), DNA 손상, 세포 독성 약물, 또는 조사 (스트레스 유도 노쇠, SIS)와 같은 다른 자극에 대한 응답으로 노화를 겪도록 유도 될 수 있음을 보여 주었다4 , 5개 , 6. 텔로미어 침식을 포함한 DNA 손상에 반응하여 세포는 노화를 시작하거나 통제되지 않은 세포 성장을 시작하거나 손상을 복구 할 수없는 경우 세포 사멸을 겪습니다. 이 경우, 세포 노화는 종양 억제 방식으로 작용하므로 유익한 것으로보인다 2. 대조적으로, 노화는 DNA 손상을 포함하여 세포 손상의 축적 때문에 노화와 함께 증가합니다. 노화 세포는 사이토카인, 금속 단백질 및 성장 인자를 분비 할 수 있기 때문에 노화 관련 분비 표현형 (SASP)이라고 불립니다.이 노화 의존적 증가는 세포 노화 및 SASP의 노화 에 의존적 증가하여 조직 항상성 감소에 기여하고 그 후 노화. 또한, 이러한 노화 에 따른 노화 부담증가는 대사성 질환, 스트레스 감수성, 프로게리아 증후군및 장애인 치유 7,8을 유발하는 것으로 알려져 있으며, 부분적으로는 수많은 노화관련 죽상동맥경화증, 골관절염, 근육변성, 궤양 형성, 및 알츠하이머병 9,10,11,12,13. 노화 세포를 제거하는 것은 조직 기능 장애를 방지하거나 지연시키고 건강 기간을 연장하는 데 도움이 될 수 있습니다14. 이는 형질전환 마우스 모델14,15,16뿐만 아니라 약물 스크리닝 노력과 생물정보학 분석을 통해 발견된 세포용해 약물 및 약물 조합을 이용하여 나타났다. 경로는 노화 세포에서 특히 유도17,18,19,20,21,22. 노화 세포 부담을 보다 효과적으로 줄일 수 있는 보다 최적의 세포 치료제를 식별하는 것은 건강한 노화를 위한 치료 접근법개발의 중요한 다음 단계입니다.
노화 세포는 배양 및 생체 내에서 특징적인 자형기능 및 분자 특징을 보여줍니다. 이 노화 마커는 이 세포에 있는 분자 변경의 원인 또는 노쇠 유도 또는 부산물 일 수 있었습니다. 그러나, 단 하나 마커는 노화 세포에서 구체적으로 찾아내지 않습니다. 현재, 노화 관련 β-갈락토시다아제(SA-β-Gal) 검출은 시험관내 및 생체 내 노화를 측정하는 가장 잘 특성화되고 확립된 단일 세포 기반 방법 중 하나이다. SA-β-Gal은 pH 4에서 최적의 효소 활성을 가진 리소좀 하이드로라제입니다. 노화 세포가 리소좀 활성이 증가하기 때문에 pH 6에서 의 활성을 측정하는 것이 가능하다23,24. 살아있는 세포의 경우, 증가된 리소좀 pH는 백액olar H +-ATPase억제제 바필로마이신 A1 또는 내인대 산성화 억제제 클로로퀸25,26을가진 리소좀 알칼리화에 의해 수득된다. 5-도데카노일아미노플루세신 디β-D-갈라코피라노사이드(C12FDG)는 12개의 탄소 지질학적 모에티(25)로 인해 세포 내의 갈라진 생성물을 유지함에 따라 살아있는 세포에서 기질로서 사용된다. 중요한 것은, SA-β-Gal 활동 자체는 노화 세포에서 확인된 어떤 통로와도 직접 연결되지 않으며 노화를 유도하기 위하여 필요하지 않습니다. 이 분석으로, 노화 세포는 더 오래된 개별에게서 피부 생검과 같은 이기종 세포 인구 및 노화 조직에서조차 확인될 수 있습니다. 또한 여러 유기체 및 조건에서 노화 세포 검출을 위한 신뢰할 수 있는 마커로서 세포 노화와노화(23) 사이의 상관관계를 보여주기 위해 사용되어왔다(27,28,29, 30. 여기서, 높은 처리량 SA-β-Gal 스크리닝 분석기 는 1차마우스 배아 섬유아세포(MEFs)를 이용하여 1차 마우스 배아 섬유아세포(MEFs)를 이용하여 형광기 판기 C 12FG를 기초로 하여 강력하고 산화적 스트레스 유도 된 세포 노화를 설명하며 그 장점과 단점을 설명한다. 논의됩니다. 이 분석법은 다른 세포 모형으로 행해질 수 있더라도, Ercc1-결핍, DNA 수선 손상MEFs의 사용은 산화 긴장의 조건 하에서 노화의 더 급속한 유도를 허용합니다. 마우스에서, DNA 수리 endonuclease ERCC1-XPF의 감소된 표현은 손상된 DNA 복구를 일으키는 원인이 되고, 내인성 DNA 손상의 가속한 축적, 상승된 ROS, 미토콘드리아 역기능, 증가된 노화 세포 부담, 줄기 세포 기능의 손실 및 조기 노화, 자연 노화와 유사31,32. 유사하게, Ercc1-결핍MEFs는 배양17에서더 빠르게 노화를 겪는다. 노화 MEF 분석의 중요한 특징은 각 우물은 노화 세포와 비 노화 세포의 혼합물을 가지고 있다는 것입니다, 노화 세포 특정 효과의 명확한 데모를 허용. 그러나, 우리는 노화를 유도하기 위하여 1 차적인 세포에 있는 산화 긴장의 사용이 더 생리적이라고 믿더라도, 이 분석은 또한 노화가 etoposide 또는 조사 같이 DNA 손상 에이전트로 유도되는 세포주로 이용될 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
SA-β-Gal은 Dimri et al.에 의해 원래 발견된 세포 노화에 대한 잘 정의된 바이오마커입니다. (1995) 노화성 인간 섬유아세포가 증식 세포에 비해 pH 623에서 분석되었을 때 SA-β-Gal의 활성이 증가한다는 것을 보여준다. 한편, SA-β-Gal에 대한 생체외 및 생체내 분석기는 상이한 세포 유형 및 조직25,39,40에대해 확?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 NIH 그랜트 AG043376에 의해 지원되었다 (프로젝트 2 및 코어 A, PDR; 프로젝트 1 및 코어 B, LJN) 및 AG056278 (프로젝트 3 및 코어 A, PDR, 프로젝트 2, LJN) 및 글렌 재단 (LJN)의 보조금.
Materials
| DMEM | Corning | 10-013-CV | medium |
| Ham's F10 | Gibco | 12390-035 | medium |
| fetal bovine serum | Tissue Culture Biologics | 101 | serum |
| 1x non-essential amino acids | Corning | 25-025-Cl | amino-acids |
| bafilomycin A1 | Sigma | B1793 | lysosomal inhibitor |
| C12FDG | Setareh Biotech | 7188 | b-Gal substrate |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H1399 | DNA intercalation agent |
| 17DMAG | Selleck Chemical LLC | 50843 | HSP90 inhibitor |
| InCell6000 Cell Imaging System | GE Healthcare | High Content Imaging System |
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