SA-β-galactosidase-baseret Screenings analyse til identifikation af Senotherapeutiske lægemidler
Summary
Cellulær senescens er den vigtigste faktor i udviklingen af kroniske aldersrelaterede patologier. Identifikation af Therapeutics at målrette senescent celler viser løfte om at forlænge sund aldring. Her præsenterer vi en ny analyse til at screene for identifikation af senotherapeutika baseret på måling af senescens associeret β-galactosidase aktivitet i enkeltceller.
Abstract
Celle senescens er en af kendetegnene ved aldring, der er kendt for at have en negativ indflydelse på en sund levetid. Stoffer i stand til at dræbe senescent celler specifikt i cellekultur, kaldet senolytika, kan reducere den senescent celle byrde in vivo og forlænge healthspan. Flere klasser af senolytika er blevet identificeret til dato, herunder HSP90-hæmmere, BCL-2-familie-hæmmere, piperlongumin, et FOXO4 hæmmende peptid og kombinationen af Dasatinib/quercetin. Påvisning af SA-β-gal ved øget lysosomale pH er en af de bedst karakteriserede markører til påvisning af senescent celler. Levende celle målinger af senescens-associeret β-galactosidase (SA-β-gal) aktivitet ved hjælp af det fluorescerende substrat C12FDG i kombination med bestemmelsen af det samlede celle nummer ved hjælp af et DNA-interkalerende Hoechst-farvestof åbner mulighed for at skærm for senotherapeutiske lægemidler, der enten reducerer den samlede SA-β-gal-aktivitet ved at dræbe senescerende celler (senolytika) eller ved at undertrykke SA-β-gal og andre fænotyper af senescent celler (senomorffer). Brug af et højt indhold fluorescerende billede erhvervelse og analyseplatform giver mulighed for en hurtig, høj gennemstrømning screening af narkotika biblioteker for effekter på SA-β-gal, celle morfologi og celle nummer.
Introduction
Cellulære gulne året blev beskrevet for første gang af Leonard Hayflick og Paul Moorhead, som viste, at normale celler havde en begrænset evne til at formere sig i kultur1. Senescent celler undlader at formere sig på trods af tilstedeværelsen af næringsstoffer, vækstfaktorer og manglende kontakt hæmning, men forbliver metabolisk aktive2. Dette fænomen er kendt som replikerende senescens og blev primært tilskrives telomere, forkortelse, i det mindste i humane celler3. Yderligere undersøgelser har vist, at celler også kan induceres til at gennemgå senescens som reaktion på andre stimuli, såsom onkogen stress (oncogene induceret senescens, OIS), DNA-skade, cytotoksiske lægemidler eller bestråling (stress induceret senescens, SIS)4 , 5 , 6. som reaktion på DNA-skader, herunder telomere, erosion, celler enten senesce, starte ukontrolleret cellevækst, eller gennemgå apoptose, hvis skaden ikke kan repareres. I dette tilfælde, celle senescens synes at være gavnlig, da det virker i en tumor suppressiv måde2. I modsætning hertil øges senescens med aldring på grund af ophobning af cellulære skader, herunder DNA-skader. Da senescent celler kan udskiller cytokiner, metalloproteinaser og vækstfaktorer, betegnet som den senescens-associerede sekretoriske fænotype (SASP), bidrager denne aldersafhængige stigning i cellulær senescens og SASP til nedsat vævs homøostase og efterfølgende ældning. Også denne aldersbetingede stigning i senescens byrden er kendt for at inducere metaboliske sygdomme, stress følsomhed, Progeria syndromer, og forringet helbredelse7,8 og er til dels ansvarlig for de talrige aldersrelaterede sygdomme, såsom åreforkalkning, slidgigt, muskel degeneration, mavesår dannelse, og Alzheimers sygdom9,10,11,12,13. Eliminering af senescent celler kan medvirke til at forebygge eller forsinke vævs dysfunktion og forlænge sociale14. Dette er blevet vist i transgene musemodeller14,15,16 samt ved hjælp af senolytiske lægemidler og narkotika kombinationer, der blev opdaget gennem både Drug screening indsats og bioinformatik analyse af veje induceret specifikt i senescent celler17,18,19,20,21,22. Identificere mere optimale senotherapeutiske lægemidler, i stand til mere effektivt at reducere den senescent celle byrde, er et vigtigt næste skridt i udviklingen af terapeutiske tilgange til sund aldring.
Senescent celler viser karakteristiske fænotypiske og molekylære egenskaber, både i kultur og in vivo. Disse senescens markører kan være enten årsag eller resultat af senescens induktion eller et biprodukt af molekylære ændringer i disse celler. Men, ingen enkelt markør er fundet specifikt i senescent celler. I øjeblikket er gulne året-associeret β-galactosidase (SA-β-gal) detektion en af de bedst karakteriserede og etablerede enkelt cellebaserede metoder til måling af senescens in vitro og in vivo. SA-β-gal er en lysosomale hydrolase med en optimal enzymatisk aktivitet ved pH 4. Måling af dets aktivitet ved pH 6 er muligt, fordi senescent celler viser øget lysosomale aktivitet23,24. For levende celler opnås øget lysosomale pH ved lysosomale alkalinisering med vakuolær H+-ATPase-hæmmeren bafilomycin a1 eller den endosomale forsurings hæmmer chloroquin25,26. 5-dodecanoylaminofluorescein di-β-D-galactopyranosid (C12FDG) anvendes som substrat i levende celler, da det bevarer det spaltet produkt i cellerne på grund af dets 12 Carbon lipofile-delen25. Vigtigere er det, at SA-β-gal-aktiviteten ikke er direkte forbundet med nogen vej, der er identificeret i senescent celler, og at den ikke er nødvendig for at fremkalde en Med denne analyse kan senescent celler identificeres selv i de heterogene cellepopulationer og aldrende væv, såsom hudbiopsier fra ældre individer. Det er også blevet brugt til at vise en sammenhæng mellem celle senescens og aldring23 , da det er en pålidelig markør for senescent celle detektion i flere organismer og betingelser27,28,29, 30. Her beskrives en høj gennemløbs-SA-β-gal-Screenings analyse baseret på det fluorescerende substrat C12FDG ved hjælp af primære mus embryonale fibroblaster (mefs) med robust oxidativ stress induceret celle stabilitet og dens fordele og ulemper drøftes. Selv om denne analyse kan udføres med forskellige celletyper, brugen af Ercc1-mangelfuld, DNA reparation svækket mefs giver mulighed for hurtigere induktion af senescens under forhold af oxidativ stress. I mus medfører reduceret ekspression af DNA-reparationen endonuklease ERCC1-XPF nedsat DNA-reparation, accelereret akkumulering af endogene DNA-skader, forhøjede ROS, mitokondriel dysfunktion, øget senescent celle byrde, tab af stamcelle funktion og for tidlig aldring, svarende til naturlig aldring31,32. På samme måde undergår Ercc1-mangelfulde mef’er en hurtigere senescens i kultur17. Et vigtigt element i den senescent MEF assay er, at hver brønd har en blanding af senescent og ikke-senescent celler, giver mulighed for en klar demonstration af senescent celle-specifikke effekter. Men selv om vi mener, at brugen af oxidativt stress i primære celler til at fremkalde senescens er mere fysiologisk, kan denne analyse også bruges med cellelinjer, hvor senescens induceres med DNA-skadelige stoffer som etoposid eller bestråling.
Protocol
Representative Results
Discussion
SA-β-gal er en veldefineret biomarkør for cellulær senescens, som oprindeligt blev opdaget af Dimri et al. (1995) viser, at senescent humane fibroblaster har øget aktivitet af SA-β-gal, når de er analyseret ved pH 623 sammenlignet med prolifererende celler. I mellemtiden er der foretaget in vitro-og in vivo-assay for SA-β-gal for forskellige celletyper og væv25,39,40. Den fluorescens base…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af NIH Grants AG043376 (projekt 2 og Core A, PDR; Projekt 1 og Core B, LJN) og AG056278 (projekt 3 og Core A, PDR; og projekt 2, LJN) og et tilskud fra Glenn Foundation (LJN).
Materials
| DMEM | Corning | 10-013-CV | medium |
| Ham's F10 | Gibco | 12390-035 | medium |
| fetal bovine serum | Tissue Culture Biologics | 101 | serum |
| 1x non-essential amino acids | Corning | 25-025-Cl | amino-acids |
| bafilomycin A1 | Sigma | B1793 | lysosomal inhibitor |
| C12FDG | Setareh Biotech | 7188 | b-Gal substrate |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H1399 | DNA intercalation agent |
| 17DMAG | Selleck Chemical LLC | 50843 | HSP90 inhibitor |
| InCell6000 Cell Imaging System | GE Healthcare | High Content Imaging System |
References
- Hayflick, L., Moorhead, P. S. The serial cultivation of human diploid cell strains. Experimental Cell Research. 25, 585-621 (1961).
- Campisi, J., di Fagagna, F. D. Cellular senescence: when bad things happen to good cells. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (9), 729-740 (2007).
- Harley, C. B., Futcher, A. B., Greider, C. W. Telomeres shorten during ageing of human fibroblasts. Nature. 345 (6274), 458-460 (1990).
- Zhu, J., Woods, D., McMahon, M., Bishop, J. M. Senescence of human fibroblasts induced by oncogenic Raf. Genes and Development. 12 (19), 2997-3007 (1998).
- Dimri, G. P., Itahana, K., Acosta, M., Campisi, J. Regulation of a senescence checkpoint response by the E2F1 transcription factor and p14(ARF) tumor suppressor. Molecular and Cellular Biology. 20 (1), 273-285 (2000).
- Michaloglou, C., et al. BRAFE600-associated senescence-like cell cycle arrest of human naevi. Nature. 436 (7051), 720-724 (2005).
- Niedernhofer, L. J. Tissue-specific accelerated aging in nucleotide excision repair deficiency. Mechanisms of Ageing and Development. 129 (78), 408-415 (2008).
- Gitenay, D., et al. Glucose metabolism and hexosamine pathway regulate oncogene-induced senescence. Cell Death & Disease. 5, e1089 (2014).
- Erusalimsky, J. D., Kurz, D. J. Cellular senescence in vivo: its relevance in ageing and cardiovascular disease. Experimental Gerontology. 40 (8-9), 634-642 (2005).
- Kassem, M., Marie, P. J. Senescence-associated intrinsic mechanisms of osteoblast dysfunctions. Aging Cell. 10 (2), 191-197 (2011).
- Campisi, J., Andersen, J. K., Kapahi, P., Melov, S. Cellular senescence: A link between cancer and age-related degenerative disease. Seminars in Cancer Biology. 21 (6), 354-359 (2011).
- Golde, T. E., Miller, V. M. Proteinopathy-induced neuronal senescence: a hypothesis for brain failure in Alzheimer’s and other neurodegenerative diseases. Alzheimers Research & Therapy. 1 (2), 5 (2009).
- Telgenhoff, D., Shroot, B. Cellular senescence mechanisms in chronic wound healing. Cell Death & Differentiation. 12 (7), 695-698 (2005).
- Baker, D. J., et al. Clearance of p16Ink4a-positive senescent cells delays ageing-associated disorders. Nature. 479 (7372), 232-236 (2011).
- Baker, D. J., et al. Naturally occurring p16-positive cells shorten healthy lifespan. Nature. , (2016).
- Childs, B. G., et al. Senescent intimal foam cells are deleterious at all stages of atherosclerosis. Science. 354 (6311), 472-477 (2016).
- Fuhrmann-Stroissnigg, H., et al. Identification of HSP90 inhibitors as a novel class of senolytics. Nature Communications. 8 (1), 422 (2017).
- Zhu, Y., et al. New agents that target senescent cells: the flavone, fisetin, and the BCL-XL inhibitors, A1331852 and A1155463. Aging. 9 (3), 955-963 (2017).
- Zhu, Y., et al. Identification of a Novel Senolytic Agent, Navitoclax, Targeting the Bcl-2 Family of Anti-Apoptotic Factors. Aging Cell. , (2015).
- Zhu, Y., et al. The Achilles’ heel of senescent cells: from transcriptome to senolytic drugs. Aging Cell. , (2015).
- Baar, M. P., et al. Targeted Apoptosis of Senescent Cells Restores Tissue Homeostasis in Response to Chemotoxicity and Aging. Cell. 169 (1), 132-147 (2017).
- Jeon, O. H., et al. Local clearance of senescent cells attenuates the development of post-traumatic osteoarthritis and creates a pro-regenerative environment. Nature. , (2017).
- Dimri, G. P., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 92 (20), 9363-9367 (1995).
- Itahana, K., Campisi, J., Dimri, G. P. Methods to detect biomarkers of cellular senescence: the senescence-associated beta-galactosidase assay. Methods in Molecular Biology. 371, 21-31 (2007).
- Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-[beta]gal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nature Protocols. 4 (12), 1798-1806 (2009).
- Cahu, J., Sola, B. A sensitive method to quantify senescent cancer cells. Journal of Visualized Experiments. 78 (78), (2013).
- Collado, M., et al. Tumour biology: Senescence in premalignant tumours. Nature. 436 (7051), 642 (2005).
- Krishnamurthy, J., et al. Ink4a/Arf expression is a biomarker of aging. The Journal of Clinical Investigation. 114 (9), 1299-1307 (2004).
- Mishima, K., et al. Senescence-associated beta-galactosidase histochemistry for the primate eye. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 40 (7), 1590-1593 (1999).
- Melk, A., et al. Expression of p16INK4a and other cell cycle regulator and senescence associated genes in aging human kidney. Kidney International. 65 (2), 510-520 (2004).
- Niedernhofer, L. J., et al. A new progeroid syndrome reveals that genotoxic stress suppresses the somatotroph axis. Nature. 444 (7122), 1038-1043 (2006).
- Wang, J., Clauson, C. L., Robbins, P. D., Niedernhofer, L. J., Wang, Y. The oxidative DNA lesions 8,5′-cyclopurines accumulate with aging in a tissue-specific manner. Aging Cell. 11 (4), 714-716 (2012).
- Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. Journal of Visualized Experiments. (64), (2012).
- Jagannathan, L., Cuddapah, S., Costa, M. Oxidative stress under ambient and physiological oxygen tension in tissue culture. Current Pharmacology Reports. 2 (2), 64-72 (2016).
- Meuter, A., et al. Markers of cellular senescence are elevated in murine blastocysts cultured in vitro: molecular consequences of culture in atmospheric oxygen. J Assist Reprod Genet. 31 (10), 1259-1267 (2014).
- Robinson, A. R., et al. Spontaneous DNA damage to the nuclear genome promotes senescence, redox imbalance and aging. Redox Biology. 17, 259-273 (2018).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal Of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
- Zhao, H., Darzynkiewicz, Z. Biomarkers of cell senescence assessed by imaging cytometry. Methods in Molecular Biology. 965, 83-92 (2013).
- Yang, N. -. C., Hu, M. -. L. A fluorimetric method using fluorescein di-β-d-galactopyranoside for quantifying the senescence-associated β-galactosidase activity in human foreskin fibroblast Hs68 cells. Analytical Biochemistry. 325 (2), 337-343 (2004).
- Zhao, J., et al. Quantitative Analysis of Cellular Senescence in Culture and In Vivo. Current Protocols in Cytometry. 79, (2017).
- Capparelli, C., et al. CDK inhibitors (p16/p19/p21) induce senescence and autophagy in cancer-associated fibroblasts, "fueling" tumor growth via paracrine interactions, without an increase in neo-angiogenesis. Cell Cycle. 11 (19), 3599-3610 (2012).
- Coppe, J. P., Desprez, P. Y., Krtolica, A., Campisi, J. The senescence-associated secretory phenotype: the dark side of tumor suppression. Annual Review of Pathology. 5, 99-118 (2010).
- Mah, L. J., El-Osta, A., Karagiannis, T. C. GammaH2AX as a molecular marker of aging and disease. Epigenetics. 5 (2), 129-136 (2010).
- Hewitt, G., et al. Telomeres are favoured targets of a persistent DNA damage response in ageing and stress-induced senescence. Nature Communications. 3, 708 (2012).
- Narita, M., et al. Rb-mediated heterochromatin formation and silencing of E2F target genes during cellular senescence. Cell. 113 (6), 703-716 (2003).
- Georgakopoulou, E. A., et al. Specific lipofuscin staining as a novel biomarker to detect replicative and stress-induced senescence. A method applicable in cryo-preserved and archival tissues. Aging-Us. 5 (1), 37-50 (2013).
- Severino, J., Allen, R. G., Balin, S., Balin, A., Cristofalo, V. J. Is β-Galactosidase Staining a Marker of Senescence in Vitro and in Vivo?. Experimental Cell Research. 257 (1), 162-171 (2000).
