Op SA-β-galactosidase gebaseerde screeningstest voor de identificatie van Senotherapeutische geneesmiddelen
Summary
Cellulaire senescentie is de belangrijkste factor in de ontwikkeling van chronische leeftijdsgebonden pathologieën. Identificatie van therapeutische middelen die gericht zijn op senescentie cellen tonen belofte voor het verlengen van gezonde veroudering. Hier presenteren we een nieuwe assay voor de identificatie van senotherapeutica op basis van meting van senescentie geassocieerde β-galactosidase activiteit in enkelvoudige cellen.
Abstract
Cell senescentie is een van de kenmerken van veroudering bekend om een negatieve invloed op een gezonde levensduur. Geneesmiddelen die in staat zijn om de senescentie cellen te doden, specifiek in de celcultuur, de zogenaamde senolytica, kunnen de senescentie-celbelasting in vivo verminderen en de healthspan verlengen. Er zijn tot nu toe meerdere klassen van senolytica geïdentificeerd, waaronder HSP90 remmers, bcl-2 familie remmers, piperlongumine, een FOXO4 remmende peptide en de combinatie van Dasatinib/quercetine. Detectie van SA-β-gal bij een verhoogde lysosomale pH is een van de best gekenmerkte markers voor de detectie van senescentie cellen. Levende celmetingen van senescentie-geassocieerde β-galactosidase (SA-β-Gal) activiteit met behulp van het fluorescerende substraat C12FDG in combinatie met de bepaling van het totale aantal cellen met behulp van een DNA intercalating Hoechst Dye opent de mogelijkheid om scherm voor senotherapeutische geneesmiddelen die ofwel de algehele SA-β-gal-activiteit verminderen door het doden van senescentie cellen (senolytica) of door het onderdrukken van SA-β-gal en andere fenotypes van senescentie cellen (senomorfen). Het gebruik van een high-content fluorescerende beeld acquisitie-en analyseplatform zorgt voor de snelle screening van medicijn bibliotheken met een hoge doorvoer voor effecten op SA-β-gal, celmorfologie en celnummer.
Introduction
Cellulaire senescentie werd voor het eerst beschreven door Leonard Hayflick en Paul Moorhead, die liet zien dat normale cellen een beperkt vermogen hadden om te vermenigvuldigen in cultuur1. Senescentie cellen niet te vermenigvuldigen ondanks de aanwezigheid van voedingsstoffen, groeifactoren en gebrek aan contact remming, maar blijven metabosch actief2. Dit fenomeen staat bekend als replicatief senescentie en werd voornamelijk toegeschreven aan de telomeer verkorting, althans in menselijke cellen3. Verdere studies hebben aangetoond dat cellen ook kunnen worden geïnduceerd om senescentie te ondergaan in reactie op andere stimuli, zoals oncogene stress (oncogene geïnduceerde senescentie, OIS), DNA-beschadiging, cytotoxische geneesmiddelen of bestraling (stress geïnduceerde senescentie, SIS)4 , 5 , 6. als reactie op DNA schade, met inbegrip van telomeer erosie, cellen ofwel senesce, start ongecontroleerde celgroei, of ondergaan apoptosis als de schade niet kan worden hersteld. In dit geval, cel senescentie lijkt te zijn gunstig als het werkt in een tumor suppressieve manier2. In tegenstelling, senescentie wordt verhoogd met veroudering als gevolg van de accumulatie van cellulaire schade met inbegrip van DNA-schade. Aangezien senescentie cellen cytokines kunnen afscheiden, matrixmetalloproteïnases en groeifactoren, aangeduid als de senescentie-geassocieerde secretoire fenotype (sasp), deze leeftijd afhankelijke toename van cellulaire senescentie en sasp draagt bij aan verminderde weefselhomeostase en vervolgens veroudert. Ook is deze leeftijdsafhankelijke toename van de senescentie last bekend voor het opwekken van metabole ziekten, stress gevoeligheid, Progeria syndromen en verstoorde genezing7,8 en is, deels, verantwoordelijk voor de talrijke leeftijdsgebonden ziekten, zoals atherosclerose, artrose, gespierde degeneratie, zweervorming, en de ziekte van Alzheimer9, 10,11,12,13. Het elimineren van senescentie cellen kan helpen om weefsel disfunctie te voorkomen of vertragen en healthspan14uit te breiden. Dit is aangetoond in transgene muismodellen14,15,16 en door gebruik te maken van senolytische geneesmiddelen en combinaties van geneesmiddelen die werden ontdekt door zowel de screening van de drug en bioinformatische analyse van trajecten specifiek geïnduceerd in de senescentie cellen17,18,19,20,21,22. Het identificeren van meer optimale senotherapeutische geneesmiddelen, in staat om de senescentie-celbelasting effectiever te verminderen, is een belangrijke volgende stap in de ontwikkeling van therapeutische benaderingen voor gezonde veroudering.
De senescentie cellen vertonen karakteristieke fenotypische en moleculaire kenmerken, zowel in de cultuur als in vivo. Deze senescentie markers kunnen ofwel de oorzaak of het resultaat zijn van senescentie inductie of een bijproduct van moleculaire veranderingen in deze cellen. Er wordt echter geen enkele marker specifiek gevonden in de senescentie cellen. Op dit moment, senescentie-geassocieerde β-galactosidase (SA-β-Gal) detectie is een van de meest gekarakteriseerde en gevestigde eencellige methoden voor het meten van senescentie in vitro en in vivo. SA-β-Gal is een lysosomale hydrolase met een optimale enzymatische activiteit bij pH 4. Het meten van zijn activiteit bij pH 6 is mogelijk, omdat de senescentie cellen een verhoogde lysosomale activiteit vertonen23,24. Voor levende cellen wordt een verhoogde lysosomale pH verkregen door lysosomale alkalisatie met de vacuole H+-ATPase-remmer bafilomycine a1 of de endosomale verzuring remmer chloroquine25,26. 5-dodecanoylaminofluorescein di-β-D-galactopyranoside (C12FDG) wordt gebruikt als substraat in levende cellen als het behoudt het gecleaved product in de cellen als gevolg van de 12 Carbon lipofiele stof25. Belangrijk is dat de SA-β-gal-activiteit zelf niet rechtstreeks verbonden is met een in de senescentie cellen geïdentificeerd traject en niet noodzakelijk is voor het induceren van senescence. Met deze test kunnen senescentie cellen worden geïdentificeerd, zelfs in heterogene celpopulaties en verouderings weefsels, zoals huid biopsieën van oudere individuen. Het is ook gebruikt om een correlatie tussen cel senescentie en veroudering van23 te laten zien, omdat het een betrouwbare marker is voor het detecteren van sencentie cellen in verschillende organismen en voorwaarden27,28,29, 30. Hier wordt een hoge doorvoer van de SA-β-gal-screeningtest op basis van het fluorescerende substraat C12FDG met behulp van primaire muis embryonale fibroblasten (mef’s) met robuuste oxidatieve stress geïnduceerde celsenescentie beschreven en de voor-en nadelen ervan worden besproken. Hoewel deze test kan worden uitgevoerd met verschillende celtypen, het gebruik van Ercc1-deficiënte, DNA-herstel verminderde mefs zorgt voor een snellere inductie van senescentie onder omstandigheden van oxidatieve stress. Bij muizen, verminderde expressie van de DNA-reparatie endonuclease ERCC1-XPF veroorzaakt verminderde DNA-herstel, versnelde accumulatie van endogene DNA-schade, verhoogde ROS, mitochondriale disfunctie, verhoogde senescentie celbelasting, verlies van stamcel functie en vroegtijdige veroudering, vergelijkbaar met natuurlijke veroudering31,32. Evenzo ondergaan Ercc1-deficiënte mef’s sneller senescentie in cultuur17. Een belangrijk kenmerk van de senescentie-MEF-test is dat elk goed een mengsel van senescentie-en niet-senescentie cellen heeft, waardoor een duidelijke demonstratie van senescentie-celspecifieke effecten mogelijk is. Hoewel we geloven dat het gebruik van oxidatieve stress in primaire cellen voor het opwekken van senescentie meer fysiologisch is, kan deze test ook worden gebruikt met cellijnen waar senescentie wordt geïnduceerd met DNA-schadelijke agentia zoals Etoposide of bestraling.
Protocol
Representative Results
Discussion
SA-β-Gal is een goed gedefinieerde biomarker voor cellulaire senescentie die oorspronkelijk werd ontdekt door Dimri et al. (1995) waaruit blijkt dat senescentie menselijke fibroblasten de activiteit van SA-β-gal hebben verhoogd bij een aanval op pH 623 in vergelijking met prolifererende cellen. Ondertussen zijn in vitro en in vivo analyse voor sa-β-gal vastgesteld voor verschillende celtypen en weefsels25,39,<sup cla…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door NIH grants AG043376 (project 2 en Core A, PDR; Project 1 en Core B, LJN) en AG056278 (project 3 en Core A, PDR; en project 2, LJN) en een subsidie van de Glenn Foundation (LJN).
Materials
| DMEM | Corning | 10-013-CV | medium |
| Ham's F10 | Gibco | 12390-035 | medium |
| fetal bovine serum | Tissue Culture Biologics | 101 | serum |
| 1x non-essential amino acids | Corning | 25-025-Cl | amino-acids |
| bafilomycin A1 | Sigma | B1793 | lysosomal inhibitor |
| C12FDG | Setareh Biotech | 7188 | b-Gal substrate |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H1399 | DNA intercalation agent |
| 17DMAG | Selleck Chemical LLC | 50843 | HSP90 inhibitor |
| InCell6000 Cell Imaging System | GE Healthcare | High Content Imaging System |
References
- Hayflick, L., Moorhead, P. S. The serial cultivation of human diploid cell strains. Experimental Cell Research. 25, 585-621 (1961).
- Campisi, J., di Fagagna, F. D. Cellular senescence: when bad things happen to good cells. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (9), 729-740 (2007).
- Harley, C. B., Futcher, A. B., Greider, C. W. Telomeres shorten during ageing of human fibroblasts. Nature. 345 (6274), 458-460 (1990).
- Zhu, J., Woods, D., McMahon, M., Bishop, J. M. Senescence of human fibroblasts induced by oncogenic Raf. Genes and Development. 12 (19), 2997-3007 (1998).
- Dimri, G. P., Itahana, K., Acosta, M., Campisi, J. Regulation of a senescence checkpoint response by the E2F1 transcription factor and p14(ARF) tumor suppressor. Molecular and Cellular Biology. 20 (1), 273-285 (2000).
- Michaloglou, C., et al. BRAFE600-associated senescence-like cell cycle arrest of human naevi. Nature. 436 (7051), 720-724 (2005).
- Niedernhofer, L. J. Tissue-specific accelerated aging in nucleotide excision repair deficiency. Mechanisms of Ageing and Development. 129 (78), 408-415 (2008).
- Gitenay, D., et al. Glucose metabolism and hexosamine pathway regulate oncogene-induced senescence. Cell Death & Disease. 5, e1089 (2014).
- Erusalimsky, J. D., Kurz, D. J. Cellular senescence in vivo: its relevance in ageing and cardiovascular disease. Experimental Gerontology. 40 (8-9), 634-642 (2005).
- Kassem, M., Marie, P. J. Senescence-associated intrinsic mechanisms of osteoblast dysfunctions. Aging Cell. 10 (2), 191-197 (2011).
- Campisi, J., Andersen, J. K., Kapahi, P., Melov, S. Cellular senescence: A link between cancer and age-related degenerative disease. Seminars in Cancer Biology. 21 (6), 354-359 (2011).
- Golde, T. E., Miller, V. M. Proteinopathy-induced neuronal senescence: a hypothesis for brain failure in Alzheimer’s and other neurodegenerative diseases. Alzheimers Research & Therapy. 1 (2), 5 (2009).
- Telgenhoff, D., Shroot, B. Cellular senescence mechanisms in chronic wound healing. Cell Death & Differentiation. 12 (7), 695-698 (2005).
- Baker, D. J., et al. Clearance of p16Ink4a-positive senescent cells delays ageing-associated disorders. Nature. 479 (7372), 232-236 (2011).
- Baker, D. J., et al. Naturally occurring p16-positive cells shorten healthy lifespan. Nature. , (2016).
- Childs, B. G., et al. Senescent intimal foam cells are deleterious at all stages of atherosclerosis. Science. 354 (6311), 472-477 (2016).
- Fuhrmann-Stroissnigg, H., et al. Identification of HSP90 inhibitors as a novel class of senolytics. Nature Communications. 8 (1), 422 (2017).
- Zhu, Y., et al. New agents that target senescent cells: the flavone, fisetin, and the BCL-XL inhibitors, A1331852 and A1155463. Aging. 9 (3), 955-963 (2017).
- Zhu, Y., et al. Identification of a Novel Senolytic Agent, Navitoclax, Targeting the Bcl-2 Family of Anti-Apoptotic Factors. Aging Cell. , (2015).
- Zhu, Y., et al. The Achilles’ heel of senescent cells: from transcriptome to senolytic drugs. Aging Cell. , (2015).
- Baar, M. P., et al. Targeted Apoptosis of Senescent Cells Restores Tissue Homeostasis in Response to Chemotoxicity and Aging. Cell. 169 (1), 132-147 (2017).
- Jeon, O. H., et al. Local clearance of senescent cells attenuates the development of post-traumatic osteoarthritis and creates a pro-regenerative environment. Nature. , (2017).
- Dimri, G. P., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 92 (20), 9363-9367 (1995).
- Itahana, K., Campisi, J., Dimri, G. P. Methods to detect biomarkers of cellular senescence: the senescence-associated beta-galactosidase assay. Methods in Molecular Biology. 371, 21-31 (2007).
- Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-[beta]gal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nature Protocols. 4 (12), 1798-1806 (2009).
- Cahu, J., Sola, B. A sensitive method to quantify senescent cancer cells. Journal of Visualized Experiments. 78 (78), (2013).
- Collado, M., et al. Tumour biology: Senescence in premalignant tumours. Nature. 436 (7051), 642 (2005).
- Krishnamurthy, J., et al. Ink4a/Arf expression is a biomarker of aging. The Journal of Clinical Investigation. 114 (9), 1299-1307 (2004).
- Mishima, K., et al. Senescence-associated beta-galactosidase histochemistry for the primate eye. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 40 (7), 1590-1593 (1999).
- Melk, A., et al. Expression of p16INK4a and other cell cycle regulator and senescence associated genes in aging human kidney. Kidney International. 65 (2), 510-520 (2004).
- Niedernhofer, L. J., et al. A new progeroid syndrome reveals that genotoxic stress suppresses the somatotroph axis. Nature. 444 (7122), 1038-1043 (2006).
- Wang, J., Clauson, C. L., Robbins, P. D., Niedernhofer, L. J., Wang, Y. The oxidative DNA lesions 8,5′-cyclopurines accumulate with aging in a tissue-specific manner. Aging Cell. 11 (4), 714-716 (2012).
- Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. Journal of Visualized Experiments. (64), (2012).
- Jagannathan, L., Cuddapah, S., Costa, M. Oxidative stress under ambient and physiological oxygen tension in tissue culture. Current Pharmacology Reports. 2 (2), 64-72 (2016).
- Meuter, A., et al. Markers of cellular senescence are elevated in murine blastocysts cultured in vitro: molecular consequences of culture in atmospheric oxygen. J Assist Reprod Genet. 31 (10), 1259-1267 (2014).
- Robinson, A. R., et al. Spontaneous DNA damage to the nuclear genome promotes senescence, redox imbalance and aging. Redox Biology. 17, 259-273 (2018).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal Of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
- Zhao, H., Darzynkiewicz, Z. Biomarkers of cell senescence assessed by imaging cytometry. Methods in Molecular Biology. 965, 83-92 (2013).
- Yang, N. -. C., Hu, M. -. L. A fluorimetric method using fluorescein di-β-d-galactopyranoside for quantifying the senescence-associated β-galactosidase activity in human foreskin fibroblast Hs68 cells. Analytical Biochemistry. 325 (2), 337-343 (2004).
- Zhao, J., et al. Quantitative Analysis of Cellular Senescence in Culture and In Vivo. Current Protocols in Cytometry. 79, (2017).
- Capparelli, C., et al. CDK inhibitors (p16/p19/p21) induce senescence and autophagy in cancer-associated fibroblasts, "fueling" tumor growth via paracrine interactions, without an increase in neo-angiogenesis. Cell Cycle. 11 (19), 3599-3610 (2012).
- Coppe, J. P., Desprez, P. Y., Krtolica, A., Campisi, J. The senescence-associated secretory phenotype: the dark side of tumor suppression. Annual Review of Pathology. 5, 99-118 (2010).
- Mah, L. J., El-Osta, A., Karagiannis, T. C. GammaH2AX as a molecular marker of aging and disease. Epigenetics. 5 (2), 129-136 (2010).
- Hewitt, G., et al. Telomeres are favoured targets of a persistent DNA damage response in ageing and stress-induced senescence. Nature Communications. 3, 708 (2012).
- Narita, M., et al. Rb-mediated heterochromatin formation and silencing of E2F target genes during cellular senescence. Cell. 113 (6), 703-716 (2003).
- Georgakopoulou, E. A., et al. Specific lipofuscin staining as a novel biomarker to detect replicative and stress-induced senescence. A method applicable in cryo-preserved and archival tissues. Aging-Us. 5 (1), 37-50 (2013).
- Severino, J., Allen, R. G., Balin, S., Balin, A., Cristofalo, V. J. Is β-Galactosidase Staining a Marker of Senescence in Vitro and in Vivo?. Experimental Cell Research. 257 (1), 162-171 (2000).
