Essai de dépistage basé sur sA-MD-Galactosidase pour l'identification des médicaments sérothérapeutiques
Summary
La sénescence cellulaire est le facteur clé dans le développement de pathologies chroniques liées à l’âge. L’identification des thérapies qui ciblent les cellules sénescentes s’avère prometteuse pour prolonger le vieillissement sain. Ici, nous présentons un essai nouveau pour l’identification des sénotherapeutics basés sur la mesure de l’activité associée de sénescence de ‘Galactosidase dans les cellules simples.
Abstract
La sénescence cellulaire est l’une des caractéristiques du vieillissement connu pour influencer négativement une durée de vie saine. Les médicaments capables de tuer les cellules sénescentes spécifiquement dans la culture cellulaire, appelées sénolytiques, peuvent réduire le fardeau cellulaire sénescent in vivo et prolonger la durée de vie. Plusieurs classes de sénolytiques ont été identifiées à ce jour, y compris les inhibiteurs du HSP90, les inhibiteurs de la famille Bcl-2, la piperlongumine, un peptide inhibiteur FOXO4 et la combinaison de Dasatinib/Quercetin. La détection de SA-A-Gal à un pH lysosomal accru est l’un des marqueurs les mieux caractérisés pour la détection des cellules sénescentes. Mesures cellulaires vivantes de l’activité de la sénescence associée à la sénescence (SA-MD-Gal) à l’aide du substrat fluorescent C12FDG en combinaison avec la détermination du nombre total de cellules à l’aide d’un colorant Hoechst intercalant l’ADN ouvre la possibilité de dépistage des médicaments sénothérapeutiques qui réduisent l’activité globale de SA-A-Gal en tuant les cellules sénescentes (sénolytiques) ou en supprimant le SA-Gal et d’autres phénotypes des cellules sénescentes (sénomorphiques). L’utilisation d’une plate-forme d’acquisition et d’analyse d’images fluorescentes à haute teneur permet le dépistage rapide et à haut débit des bibliothèques de médicaments pour les effets sur sA-MD-Gal, la morphologie cellulaire et le numéro de cellulaire.
Introduction
La sénescence cellulaire a été décrite pour la première fois par Leonard Hayflick et Paul Moorhead, qui ont montré que les cellules normales avaient une capacité limitée à proliférer dans la culture1. Les cellules sénescentes ne prolifèrent pas malgré la présence de nutriments, les facteurs de croissance et le manque d’inhibition du contact, mais restent métaboliquement actives2. Ce phénomène est connu sous le nom de sénescence réplicative et a été principalement attribué au raccourcissement des télomères, au moins dans les cellules humaines3. D’autres études ont montré que les cellules peuvent également être induites à subir la sénescence en réponse à d’autres stimuli, tels que le stress oncogène (sénescence induite par l’oncogène, OIS), les dommages à l’ADN, les médicaments cytotoxiques, ou l’irradiation (sénescence induite par le stress, SIS)4 , 5 Annonces , 6. En réponse aux dommages à l’ADN, y compris l’érosion des télomères, les cellules séneesce, commencent la croissance cellulaire incontrôlée, ou subissent l’apoptose si les dommages ne peuvent pas être réparés. Dans ce cas, la sénescence cellulaire semble être bénéfique car elle agit d’une manière suppressive de tumeur2. En revanche, la sénescence est augmentée avec le vieillissement dû à l’accumulation des dommages cellulaires comprenant des dommages d’ADN. Puisque les cellules sénescentes peuvent sécrétiser des cytokines, des metalloproteinases et des facteurs de croissance, appelés phénotype sécréteur sénieux séniescence-associés (SASP), cette augmentation âge-dépendante de la sénescence cellulaire et sASP contribue à l’homéostasie diminuée de tissu et par la suite le vieillissement. En outre, cette augmentation dépendante de l’âge de la charge de sénescence est connue pour induire des maladies métaboliques, la sensibilité au stress, les syndromes de progeria, et la guérison altérée7,8 et est, en partie, responsable des nombreux âges liés maladies, telles que l’athérosclérose, l’arthrose, la dégénérescence musculaire, la formation d’ulcères, et la maladie d’Alzheimer9,10,11,12,13. L’élimination des cellules sénescentes peut aider à prévenir ou retarder le dysfonctionnement des tissus et à prolonger l’étendue de la santé14. Cela a été démontré dans les modèles de souris transgéniques14,15,16 ainsi qu’en utilisant des médicaments sénolytiques et des combinaisons de médicaments qui ont été découverts à la fois par les efforts de dépistage des médicaments et l’analyse bioinformatique de voies induites spécifiquement dans les cellules sénescentes17,18,19,20,21,22. L’identification de médicaments sénothérapeutiques plus optimaux, capables de réduire plus efficacement le fardeau cellulaire sénescent, est une prochaine étape importante dans le développement d’approches thérapeutiques pour le vieillissement en santé.
Les cellules sénescentes présentent des caractéristiques phénotypiques et moléculaires, tant en culture qu’in vivo. Ces marqueurs de sénescence pourraient être la cause ou le résultat de l’induction de sénescence ou un sous-produit des changements moléculaires dans ces cellules. Cependant, aucun marqueur unique n’est trouvé spécifiquement dans les cellules sénescentes. À l’heure actuelle, la détection de la sénescence associée à la sénescence est l’une des méthodes à base de cellules individuelles les mieux caractérisées et établies pour mesurer la sénescence in vitro et in vivo. SA-Gal est une hydrolase lysosomale avec une activité enzymatique optimale au pH 4. La mesure de son activité au pH 6 est possible parce que les cellules sénescentes montrent une activité lysosomale accrue23,24. Pour les cellules vivantes, l’augmentation du pH lysosomal est obtenue par alcalinisation lysosomale avec l’inhibiteur vacuolar H -ATPase Bafilomycin A1 ou l’inhibiteur de l’acidification endosomal chloroquine25,26. 5-Dodecanoylaminofluorescein Di-MD-D-galactopyranoside (C12FDG) est utilisé comme substrat dans les cellules vivantes car il conserve le produit clivé dans les cellules en raison de sa moiétologie lipophile de 12 carbone25. Fait important, l’activité de SA–Gal elle-même n’est pas directement liée à une voie identifiée dans les cellules sénescentes et n’est pas nécessaire pour induire la sénescence. Avec cet analyse, les cellules sénescentes peuvent être identifiées même dans les populations hétérogènes de cellules et les tissus vieillissants, tels que des biopsies de peau des individus plus âgés. Il a également été utilisé pour montrer une corrélation entre la sénescence cellulaire et le vieillissement23 car il est un marqueur fiable pour la détection des cellules sénescentes dans plusieurs organismes et les conditions27,28,29, 30. Ici, un test de dépistage à haut débit SA-M-Gal basé sur le substrat fluorescent C12FDG à l’aide de fibroblastes embryonnaires de souris primaires (MEFs) avec une sénescence cellulaire induite par le stress solidement oxydatif est décrit et ses avantages et inconvénients sont discutés. Bien que cet analyse puisse être effectué avec différents types de cellules, l’utilisation d’Ercc1-déficient, MEFs altérés de réparation d’ADN permet l’induction plus rapide de la sénescence dans des conditions de stress oxydatif. Chez la souris, l’expression réduite de l’endodocléère d’ENdonuclease d’ADN ERCC1-XPF cause la réparation altérée d’ADN, l’accumulation accélérée des dommages endogènes d’ADN, le ROS élevé, le dysfonctionnement mitochondrique, le fardeau sénescent accru de cellules, la perte de fonction de cellules souches et vieillissement prématuré, semblable au vieillissement naturel31,32. De même, Ercc1-déficients MEFs subissent une sénescence plus rapide dans la culture17. Une caractéristique importante de l’exemple sénescent MEF est que chaque puits a un mélange de cellules sénescentes et non-sénescentes, permettant la démonstration claire des effets sénescents de cellules spécifiques. Cependant, bien que nous croyons que l’utilisation du stress oxydatif dans les cellules primaires pour induire la sénescence est plus physiologique, cet essai peut également être employé avec des lignes cellulaires où la sénescence est induite avec des agents dommageables d’ADN comme l’étoposide ou l’irradiation.
Protocol
Representative Results
Discussion
SA-MD-Gal est un biomarqueur bien défini pour la sénescence cellulaire découvert à l’origine par Dimri et al. (1995) montrant que les fibroblastes humains sénescents ont augmenté l’activité de SA-A-Gal lorsqu’ils sont évalués au pH 623 par rapport aux cellules proliférantes. Pendant ce temps, l’analyse in vitro et in vivo pour SA–Gal ont été établis pour différents types de cellules et de tissus25,39,<sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par LES subventions des NIH AG043376 (Projet 2 et Core A, PDR; Projet 1 et Core B, LJN) et AG056278 (Projet 3 et Core A, PDR; et Projet 2, LJN) et une subvention de la Glenn Foundation (LJN).
Materials
| DMEM | Corning | 10-013-CV | medium |
| Ham's F10 | Gibco | 12390-035 | medium |
| fetal bovine serum | Tissue Culture Biologics | 101 | serum |
| 1x non-essential amino acids | Corning | 25-025-Cl | amino-acids |
| bafilomycin A1 | Sigma | B1793 | lysosomal inhibitor |
| C12FDG | Setareh Biotech | 7188 | b-Gal substrate |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H1399 | DNA intercalation agent |
| 17DMAG | Selleck Chemical LLC | 50843 | HSP90 inhibitor |
| InCell6000 Cell Imaging System | GE Healthcare | High Content Imaging System |
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