א-β-גלטוסידאז-מבוסס על הקרנת ההקרנה לזיהוי תרופות הסאותרפיה
Summary
הזדקנות תאית היא הגורם העיקרי בפיתוח של הפתווגיות הקשורות לגיל כרונית. זיהוי של הtherapeutics שתאי היעד מציגים הבטחה להרחבת הזדקנות בריאה. כאן, אנו מציגים את הבקשה הרומן על המסך לזיהוי של senotherapeutics מבוסס על מדידה של פעילות ביולוגית β-גלטוסידאז הקשורים בתאים בודדים.
Abstract
הזדקנות התא הוא אחד הסימנים ההיכר של ההזדקנות ידוע להשפיע על תוחלת חיים בריאה. תרופות מסוגל להרוג תאים senescent במיוחד בתרבות התא, כינה senolytics, יכול להפחית את הנטל התא הסנאני בvivo ולהאריך את ברינספנה. מספר מחלקות של senolytics זוהו עד כה כולל HSP90 מעכבי, Bcl-2 מעכבי משפחה, piperlongumine, פפטיד FOXO4 מעכבות ושילוב של Dasatinib/Quercetin. זיהוי של SA-β-Gal ב-pH מוגברת למטה הוא אחד הסמנים המאופיינת הטוב ביותר לזיהוי של תאים הסנאים. מדידות התאים הβ-גלטוסידאז (SA-β-Gal) באמצעות מצע הפלורסנט C12fdg בשילוב עם קביעת מספר התאים הכולל באמצעות הצבע המשולב DNA שפותח את האפשרות ל מסך עבור תרופות senotherapeutic המקטינה את הפעילות הכוללת של SA-β-Gal על-ידי הריגת תאים סנסטיים (senotherapeutic) או על-ידי דיכוי SA-β-Gal ופנוטיפים אחרים של תאים סנסטיים (senomמורקס). שימוש בפלטפורמת הרכישה והניתוח של תמונת פלורסנט באיכות גבוהה מאפשר הקרנת תפוקה מהירה וגבוהה של ספריות תרופות לאפקטים ב-SA-β-Gal, מורפולוגיה של תאים ומספר תאים.
Introduction
הזדקנות תאית תוארה בפעם הראשונה על ידי ליאונרד הייפליק ו פול מורהד, אשר הראה כי תאים נורמליים יש יכולת מוגבלת להתרבות בתרבות1. תאי הסנקו אינם מתרבים למרות הנוכחות של חומרים מזינים, גורמי גדילה וחוסר במגע מעכבות, אבל להישאר metabolically פעיל2. תופעה זו ידועה בתור הזדקנות מחודשת והיא יוחסה בעיקר לקיצור טלומר, לפחות בתאים אנושיים3. מחקרים נוספים הראו כי התאים יכולים גם להיות המושרה לעבור הזדקנות בתגובה גירויים אחרים, כגון הלחץ אונגניים (אוננציה המושרה, או), נזק לדנ א, תרופות ציטוטוקסיים, או הקרנה (הנגרמת באופן מלחיץ, SIS)4 , מיכל 5 , 6. בתגובה לנזק לדנ א, כולל הסחף טלומר, תאים מאוהים, להתחיל צמיחת תאים בלתי מבוקרת, או לעבור אפופטוזיס אם הנזק לא ניתן לתקן. במקרה זה, הזדקנות התא נראה מועיל כפי שהוא פועל בצורה מדכאים הגידול2. לעומת זאת, הזדקנות מוגברת עם ההזדקנות בשל הצטברות של נזק הסלולר כולל נזק לדנ א. מאז התאים הסננסלי יכול להפריש ציטוקינים, מטאלופרוטאינסים וגורמי גדילה, כינה את האג הסודי הקשור הפרשה (sasp), זו עלייה בגיל תלוי בתקופת הזדקנות הסלולר sasp תורמת הומאוסטזיס רקמות ירידה ו לאחר מכן הזדקנות. כמו כן, גידול זה תלוי גיל בנטל הזדקנות ידוע לגרום מחלות מטבולית, רגישות למתח, תסמונות פרוגריה, לקויי ריפוי7,8 והוא, בין השאר, אחראי על רבים הקשורים לגיל מחלות, כגון טרשת עורקים, אוסטיאוארתריטיס, ניוון שרירים, היווצרות כיב, ומחלת אלצהיימר9,10,11,12,13. ביטול תאים senescent יכול לעזור למנוע או לעכב את תפקוד הרקמה ולהאריך את בריבן14. זה הוצג במודלים העכבר הטרנסגניים14,15,16 , כמו גם באמצעות תרופות ושילובי סמים שנתגלו באמצעות מאמצי סינון סמים וניתוח ביולוגי של מסלולים המושרה במיוחד בתאי הס,17,18,19,20,21,22. זיהוי התרופות הטיפוליות האופטימליות יותר, היכולת לצמצם ביעילות רבה יותר את הנטל החיצוני של התא, הוא השלב הבא חשוב בפיתוח גישות טיפוליות להזדקנות בריאה.
התאים הסנאריים מציגים תכונות פנוטיטיות ומולקולריות אופייניות, הן בתרבות והן בvivo. אלה סמנים הזדקנות יכול להיות הגורם או תוצאה של אינדוקציה הזדקנות או תוצר לוואי של שינויים מולקולריים בתאים אלה. עם זאת, אף סמן יחיד לא נמצא באופן ספציפי בתאי הסנקו. כיום, זיהוי הβ-גלטוסידאז (SA-β-Gal) הוא אחד השיטות המבוססות על תאים בודדים ומבוססות-תא יחיד למדידת הזדקנות בתוך מבחנה ובvivo. SA-β-גל הוא הידרוקלז ליסוזומל עם פעילות אנזימטית אופטימלית ב-pH 4. מדידת פעילותה ב-pH 6 אפשרי מכיוון שתאי הסנסזים מראים פעילות ליזוזומלית מוגברת23,24. עבור תאים חיים, pH מוגברת ליזוזומל מושגת על ידי ליסוזומיום המלחה עם וולאואר H+-atpase מעכבי Bafilomycin A1 או אנדוזומחמצה מעכבי ככלורוקין25,26. 5-Dodecanoylaminofluorescein Di-β-D-גלפטוטוסייד (C12fdg) משמש מצע בתאי החיים כפי שהוא שומר על מוצר ביקע בתאים בשל 12 הפחמן ליפופילית moiety25. חשוב לעשות זאת, SA-β-Gal הפעילות עצמה אינה מחוברת ישירות עם כל מסלול מזוהה בתאי הסנקו והוא אינו נחוץ כדי לגרום הזדקנות. בעזרת שיטת הפעולה הזאת, ניתן לזהות את תאי הסנסאלים גם באוכלוסיות הטרוגניות וברקמות ההזדקנות, כגון ביופסיות עור מאנשים מבוגרים. זה גם שימש כדי להראות מתאם בין הזדקנות התא ההזדקנות23 כפי שהוא סמן אמין עבור זיהוי תא הסננסאס במספר אורגניזמים ותנאים27,28,29, . בסדר, 30 כאן, התפוקה הגבוהה SA-β-Gal הקרנת מבוסס על מצע פלורסנט C12fdg באמצעות העכבר הראשי מעובריים מתחלקים (mefs) עם לחץ חמצוני הנגרמת על ידי הזדקנות התא מתוארת היתרונות והחסרונות שלה נדונים. למרות שניתן לבצע את התיקון הזה עם סוגים שונים של תאים, השימוש Ercc1-לקוי, DNA תיקון לקוי mefs מאפשר אינדוקציה מהירה יותר של הזדקנות בתנאים של לחץ חמצוני. בעכברים, ביטוי מופחת של תיקון ה-dna endonuclease ERCC1-xpf גורם לקויי dna תיקון, הצטברות מואצת של נזק dna אנדוסוגני, מוגבה ROS, בתפקוד מיטוכונדריאלי, מוגברת נטל תא העין, אובדן תפקוד תא גזע ו הזדקנות מוקדמת, דומה להזדקנות טבעית31,32. באופן דומה, Ercc1-mefs לקוי לעבור הזדקנות במהירות רבה יותר בתרבות17. תכונה חשובה של שיטת ה-MEF של הארגון היא שבכל החדרים יש שילוב של תאים מיוחדים ובלתי-מוגדרים, ומאפשרים הדגמה ברורה של השפעות מיוחדות לתאים. עם זאת, למרות שאנו מאמינים כי השימוש בלחץ חמצוני בתאים הראשוניים כדי לגרום הזדקנות הוא פיזיולוגי יותר, שיטת זה גם ניתן להשתמש עם קווי התא שבו הזדקנות המושרה עם סוכני DNA נזק כמו etפאות או הקרנה.
Protocol
Representative Results
Discussion
SA-β-Gal הוא ביואריקר מוגדר היטב עבור הזדקנות הסלולר התגלתה במקור על ידי Dimri et al. (1995) מראה כי שהפיצוצים האנושיים הסחיים יש להגדיל את הפעילות של SA-β-Gal כאשר העלה ב-pH 623 לעומת תאים מתרבים. בינתיים, בתוך מבחנה ובvivo של SA-β-Gal הוקמו עבור סוגי תאים שונים ורקמות25,<sup clas…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת על ידי NIH מענקים AG043376 (פרויקט 2 ו-Core A, PDR; פרוייקט 1 ו-Core B, LJN) ו-AG056278 (פרוייקט 3 ו-Core A, PDR; ו-Project 2, LJN) ומענק מקרן גלן (LJN).
Materials
| DMEM | Corning | 10-013-CV | medium |
| Ham's F10 | Gibco | 12390-035 | medium |
| fetal bovine serum | Tissue Culture Biologics | 101 | serum |
| 1x non-essential amino acids | Corning | 25-025-Cl | amino-acids |
| bafilomycin A1 | Sigma | B1793 | lysosomal inhibitor |
| C12FDG | Setareh Biotech | 7188 | b-Gal substrate |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H1399 | DNA intercalation agent |
| 17DMAG | Selleck Chemical LLC | 50843 | HSP90 inhibitor |
| InCell6000 Cell Imaging System | GE Healthcare | High Content Imaging System |
References
- Hayflick, L., Moorhead, P. S. The serial cultivation of human diploid cell strains. Experimental Cell Research. 25, 585-621 (1961).
- Campisi, J., di Fagagna, F. D. Cellular senescence: when bad things happen to good cells. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (9), 729-740 (2007).
- Harley, C. B., Futcher, A. B., Greider, C. W. Telomeres shorten during ageing of human fibroblasts. Nature. 345 (6274), 458-460 (1990).
- Zhu, J., Woods, D., McMahon, M., Bishop, J. M. Senescence of human fibroblasts induced by oncogenic Raf. Genes and Development. 12 (19), 2997-3007 (1998).
- Dimri, G. P., Itahana, K., Acosta, M., Campisi, J. Regulation of a senescence checkpoint response by the E2F1 transcription factor and p14(ARF) tumor suppressor. Molecular and Cellular Biology. 20 (1), 273-285 (2000).
- Michaloglou, C., et al. BRAFE600-associated senescence-like cell cycle arrest of human naevi. Nature. 436 (7051), 720-724 (2005).
- Niedernhofer, L. J. Tissue-specific accelerated aging in nucleotide excision repair deficiency. Mechanisms of Ageing and Development. 129 (78), 408-415 (2008).
- Gitenay, D., et al. Glucose metabolism and hexosamine pathway regulate oncogene-induced senescence. Cell Death & Disease. 5, e1089 (2014).
- Erusalimsky, J. D., Kurz, D. J. Cellular senescence in vivo: its relevance in ageing and cardiovascular disease. Experimental Gerontology. 40 (8-9), 634-642 (2005).
- Kassem, M., Marie, P. J. Senescence-associated intrinsic mechanisms of osteoblast dysfunctions. Aging Cell. 10 (2), 191-197 (2011).
- Campisi, J., Andersen, J. K., Kapahi, P., Melov, S. Cellular senescence: A link between cancer and age-related degenerative disease. Seminars in Cancer Biology. 21 (6), 354-359 (2011).
- Golde, T. E., Miller, V. M. Proteinopathy-induced neuronal senescence: a hypothesis for brain failure in Alzheimer’s and other neurodegenerative diseases. Alzheimers Research & Therapy. 1 (2), 5 (2009).
- Telgenhoff, D., Shroot, B. Cellular senescence mechanisms in chronic wound healing. Cell Death & Differentiation. 12 (7), 695-698 (2005).
- Baker, D. J., et al. Clearance of p16Ink4a-positive senescent cells delays ageing-associated disorders. Nature. 479 (7372), 232-236 (2011).
- Baker, D. J., et al. Naturally occurring p16-positive cells shorten healthy lifespan. Nature. , (2016).
- Childs, B. G., et al. Senescent intimal foam cells are deleterious at all stages of atherosclerosis. Science. 354 (6311), 472-477 (2016).
- Fuhrmann-Stroissnigg, H., et al. Identification of HSP90 inhibitors as a novel class of senolytics. Nature Communications. 8 (1), 422 (2017).
- Zhu, Y., et al. New agents that target senescent cells: the flavone, fisetin, and the BCL-XL inhibitors, A1331852 and A1155463. Aging. 9 (3), 955-963 (2017).
- Zhu, Y., et al. Identification of a Novel Senolytic Agent, Navitoclax, Targeting the Bcl-2 Family of Anti-Apoptotic Factors. Aging Cell. , (2015).
- Zhu, Y., et al. The Achilles’ heel of senescent cells: from transcriptome to senolytic drugs. Aging Cell. , (2015).
- Baar, M. P., et al. Targeted Apoptosis of Senescent Cells Restores Tissue Homeostasis in Response to Chemotoxicity and Aging. Cell. 169 (1), 132-147 (2017).
- Jeon, O. H., et al. Local clearance of senescent cells attenuates the development of post-traumatic osteoarthritis and creates a pro-regenerative environment. Nature. , (2017).
- Dimri, G. P., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 92 (20), 9363-9367 (1995).
- Itahana, K., Campisi, J., Dimri, G. P. Methods to detect biomarkers of cellular senescence: the senescence-associated beta-galactosidase assay. Methods in Molecular Biology. 371, 21-31 (2007).
- Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-[beta]gal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nature Protocols. 4 (12), 1798-1806 (2009).
- Cahu, J., Sola, B. A sensitive method to quantify senescent cancer cells. Journal of Visualized Experiments. 78 (78), (2013).
- Collado, M., et al. Tumour biology: Senescence in premalignant tumours. Nature. 436 (7051), 642 (2005).
- Krishnamurthy, J., et al. Ink4a/Arf expression is a biomarker of aging. The Journal of Clinical Investigation. 114 (9), 1299-1307 (2004).
- Mishima, K., et al. Senescence-associated beta-galactosidase histochemistry for the primate eye. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 40 (7), 1590-1593 (1999).
- Melk, A., et al. Expression of p16INK4a and other cell cycle regulator and senescence associated genes in aging human kidney. Kidney International. 65 (2), 510-520 (2004).
- Niedernhofer, L. J., et al. A new progeroid syndrome reveals that genotoxic stress suppresses the somatotroph axis. Nature. 444 (7122), 1038-1043 (2006).
- Wang, J., Clauson, C. L., Robbins, P. D., Niedernhofer, L. J., Wang, Y. The oxidative DNA lesions 8,5′-cyclopurines accumulate with aging in a tissue-specific manner. Aging Cell. 11 (4), 714-716 (2012).
- Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. Journal of Visualized Experiments. (64), (2012).
- Jagannathan, L., Cuddapah, S., Costa, M. Oxidative stress under ambient and physiological oxygen tension in tissue culture. Current Pharmacology Reports. 2 (2), 64-72 (2016).
- Meuter, A., et al. Markers of cellular senescence are elevated in murine blastocysts cultured in vitro: molecular consequences of culture in atmospheric oxygen. J Assist Reprod Genet. 31 (10), 1259-1267 (2014).
- Robinson, A. R., et al. Spontaneous DNA damage to the nuclear genome promotes senescence, redox imbalance and aging. Redox Biology. 17, 259-273 (2018).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal Of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
- Zhao, H., Darzynkiewicz, Z. Biomarkers of cell senescence assessed by imaging cytometry. Methods in Molecular Biology. 965, 83-92 (2013).
- Yang, N. -. C., Hu, M. -. L. A fluorimetric method using fluorescein di-β-d-galactopyranoside for quantifying the senescence-associated β-galactosidase activity in human foreskin fibroblast Hs68 cells. Analytical Biochemistry. 325 (2), 337-343 (2004).
- Zhao, J., et al. Quantitative Analysis of Cellular Senescence in Culture and In Vivo. Current Protocols in Cytometry. 79, (2017).
- Capparelli, C., et al. CDK inhibitors (p16/p19/p21) induce senescence and autophagy in cancer-associated fibroblasts, "fueling" tumor growth via paracrine interactions, without an increase in neo-angiogenesis. Cell Cycle. 11 (19), 3599-3610 (2012).
- Coppe, J. P., Desprez, P. Y., Krtolica, A., Campisi, J. The senescence-associated secretory phenotype: the dark side of tumor suppression. Annual Review of Pathology. 5, 99-118 (2010).
- Mah, L. J., El-Osta, A., Karagiannis, T. C. GammaH2AX as a molecular marker of aging and disease. Epigenetics. 5 (2), 129-136 (2010).
- Hewitt, G., et al. Telomeres are favoured targets of a persistent DNA damage response in ageing and stress-induced senescence. Nature Communications. 3, 708 (2012).
- Narita, M., et al. Rb-mediated heterochromatin formation and silencing of E2F target genes during cellular senescence. Cell. 113 (6), 703-716 (2003).
- Georgakopoulou, E. A., et al. Specific lipofuscin staining as a novel biomarker to detect replicative and stress-induced senescence. A method applicable in cryo-preserved and archival tissues. Aging-Us. 5 (1), 37-50 (2013).
- Severino, J., Allen, R. G., Balin, S., Balin, A., Cristofalo, V. J. Is β-Galactosidase Staining a Marker of Senescence in Vitro and in Vivo?. Experimental Cell Research. 257 (1), 162-171 (2000).
