Saggio di screening basato su SA-Galactosidase per l'identificazione dei farmaci senoterapici

Summary

La senescenza cellulare è il fattore chiave nello sviluppo di patologie croniche legate all’età. L’identificazione delle terapie che colpisce le cellule senescenti è promettente per estendere l’invecchiamento sano. Qui, presentiamo un nuovo saggio da vagliare per l’identificazione delle senoterapie sulla base della misurazione dell’attività di senescenza associata a z-Galactosidase in singole cellule.

Abstract

La senescenza cellulare è uno dei segni distintivi dell’invecchiamento noto per influenzare negativamente una vita sana. I farmaci in grado di uccidere le cellule senescenti specificamente nella coltura cellulare, chiamato senolitico, possono ridurre il carico di cellule senescenti in vivo ed estendere la salute. Diverse classi di senolitica sono state identificate fino ad oggi, tra cui inibitori HSP90, inibitori della famiglia Bcl-2, piperlongumine, un peptide inibitorio FOXO4 e la combinazione di Dasatinib/Quercetin. La rilevazione di SA-z-Gal in un pH lisonico aumentato è uno dei migliori marcatori caratterizzati per la rilevazione di cellule senescenti. Le misurazioni delle cellule vive dell’attività di senescenza associati alla galactosidasi (SA-z-Gal) utilizzando il substrato fluorescente C₁₂FDG in combinazione con la determinazione del numero totale di cellule utilizzando un colorante Hoechst intercalante del DNA apre la possibilità di schermo per i farmaci senoteri che riducono l’attività complessiva di SA-z-Gal uccidendo cellule senescenti (senolytica) o sopprimendo SA-z-Gal e altri fenotipi delle cellule senescenti (senomorfici). L’uso di una piattaforma di acquisizione e analisi di immagini fluorescenti ad alto contenuto consente di uno screening rapido e ad alto consumo delle librerie di farmaci per gli effetti sulla SA-z-Gal, la morfologia cellulare e il numero di cellule.

Introduction

La senescenza cellulare è stata descritta per la prima volta da Leonard Hayflick e Paul Moorhead, che hanno dimostrato che le cellule normali avevano una capacità limitata di proliferare nella coltura¹. Le cellule senescenti non riescono a proliferare nonostante la presenza di nutrienti, fattori di crescita e mancanza di inibizione del contatto, ma rimangono metabolicamente attivi². Questo fenomeno è noto come senescenza replicativa ed è stato attribuito principalmente all’accorciamento dei telomeri, almeno nelle cellule umane³. Ulteriori studi hanno dimostrato che le cellule possono anche essere indotte a subire senescenza in risposta ad altri stimoli, come lo stress oncogenico (senescenza indotta dall’oncogeno, OIS), danni al DNA, farmaci citotossici o irradiazione (senescenza indotta dallo stress, SIS)^{4 , 5} Del numero 3( ^{, 6}. In risposta al danno del DNA, compresa l’erosione dei telomeri, le cellule possono senescere, iniziano la crescita cellulare incontrollata o subiscono l’apoptosi se il danno non può essere riparato. In questo caso, la senescenza cellulare sembra essere utile in quanto agisce in modo repressivo tumorale². Al contrario, la senescenza è aumentata con l’invecchiamento a causa dell’accumulo di danni cellulari tra cui il danno al DNA. Poiché le cellule senescenti possono secernere citochine, proteinasi di metallo e fattori di crescita, chiamato fenotipo secretoria associato alla senescenza (SASP), questo aumento dipendente dall’età della senescenza cellulare e sAS contribuisce alla diminuzione dell’omeostasi del tessuto e successivamente l’invecchiamento. Inoltre, questo aumento dipendente dall’età del carico di senescenza è noto per indurre malattie metaboliche, sensibilità allo stress, sindromi di progeria e guarigione alterata^7,8 ed è, in parte, responsabile delle numerose età-correlati malattie, come l’aterosclerosi, l’osteoartrite, la degenerazione muscolare, la formazione di ulcere e il morbo di Alzheimer^{9,10,11,12,13}. Eliminare le cellule senescenti può aiutare a prevenire o ritardare la disfunzione tissutale ed estendere la durata di salute¹⁴. Ciò è stato dimostrato nei modelli murini transgenici^14,15,16, nonché utilizzando farmaci senolitici e combinazioni di farmaci che sono stati scoperti sia attraverso gli sforzi di screening farmacologico che l’analisi bioinformatica di percorsi indotti specificamente nelle cellule senescenti^{17,18,19,20,21,22}. Identificare farmaci senoteri ottimali, in grado di ridurre in modo più efficace l’onere cellulare senescente, è un importante passo avanti nello sviluppo di approcci terapeutici per un invecchiamento sano.

Le cellule senescenti mostrano caratteristiche fenotipiche e molecolari caratteristiche, sia in coltura che in vivo. Questi marcatori di senescenza potrebbero essere la causa o il risultato dell’induzione della senescenza o un sottoprodotto dei cambiamenti molecolari in queste cellule. Tuttavia, nessun singolo marcatore si trova specificamente nelle cellule senescenti. Attualmente, il rilevamento associato alla senescenza con la galactosidase (SA-z-Gal) è uno dei metodi basati su una singola cellula più caratterizzati e consolidati per misurare la senescenza in vitro e in vivo. L’idrolasi lisosomia con un’attività enzimatica ottimale al pH 4 è un idrolasi lisoso. Misurare la sua attività al pH 6 è possibile perché le cellule senescenti mostrano una maggiore attività lisosomica^23,24. Per le cellule viventi, l’aumento del pH lisosomiale si ottiene con alcalinizzazione lisosomica con il vacuolar H^–L’inibitore di A!mycin A1 o l’inibitore dell’acidificazione endosomica cloroquine^25,26. 5-Dodecanoylaminofluorescein Di-C₁₂FDG) viene utilizzato come substrato nelle cellule viventi in quanto mantiene il prodotto fessurato nelle cellule a causa della sua moiety²⁵lipofilica al carbonio. È importante sottolineare che l’attività SA-z-Gal stessa non è direttamente collegata ad alcuna via identificata nelle cellule senescenti e non è necessaria per indurre la senescenza. Con questo test, le cellule senescenti possono essere identificate anche nelle popolazioni cellulari eterogenee e nei tessuti di invecchiamento, come le biopsie cutanee di individui più anziani. E ‘stato utilizzato anche per mostrare una correlazione tra senescenza cellulare e invecchiamento²³ in quanto è un marcatore affidabile per il rilevamento delle cellule senescenti in diversi organismi e condizioni^{27,28,29, 30}. In questo caso, viene descritto un saggio di screening SA-z-Gal ad alta produttività basato sul substrato fluorescente C₁₂FDG che utilizza fibroblasti embrionali primari (MEF) con senescenza cellulare indotta dallo stress fortemente ossidativo e dei suoi vantaggi e svantaggi sono discussi. Anche se questo saggio può essere eseguito con diversi tipi di cellule, l’uso di Ercc1-deficient, DNA riparazione COMme compromessa consente una più rapida induzione di senescenza in condizioni di stress ossidativo. Nei topi, l’espressione ridotta dell’endonuclease del DNA endaccleatta ERCC1-XPF causa una riparazione compromessa del DNA, un accumulo accelerato di danni endogeni del DNA, ROS elevato, disfunzione mitocondriale, aumento del carico di cellule senescenti, perdita della funzione delle cellule staminali e invecchiamento precoce, simile all’invecchiamento naturale^31,32. Allo stesso modo, i MEF carenti di Ercc1subiscono più rapidamente la senescenza nella cultura¹⁷. Una caratteristica importante del saggio SENescente MEF è che ogni pozzo ha una miscela di cellule senescenti e non senescenti, consentendo la chiara dimostrazione di effetti senescenti specifici delle cellule. Tuttavia, anche se crediamo che l’uso dello stress ossidativo nelle cellule primarie per indurre la senescenza sia più fisiologico, questo saggio può essere utilizzato anche con linee cellulari in cui la senescenza è indotta da agenti dannosi del DNA come l’etoposide o l’irradiazione.

Protocol

L’uso degli animali è stato approvato dallo Scripps Florida Institutional Animal Care and Use Committee. 1. Generazione di fibroblasto embrionale murino senescente (MEF) – 12-15 giorni Isolare il tipo selvaggio e Ercc1-/- MEF da topi femmine in gravidanza alla giornata embrionale 13 (E13) come descritto in precedenza33.NOTA: Tutti i seguenti passaggi vengono eseguiti in una cappa di coltura tissutale in condizioni asettiche e utilizz…

Representative Results

L’attività di SA-z-Gal può essere rilevata in cellule che sono indotte a senescenza da vari modi da esaurimento replicativo, stress genotossico e ossidativo, all’attivazione dell’oncogene23,25,38. Nell’attuale modello che utilizza le cellule fibroblaste embrionali di Ercc1- carenti, le condizioni di crescita normossiche (20% O2) erano sufficienti a indurre la senescenza cell…

Discussion

È un biomarcatore ben definito per la senescenza cellulare originariamente scoperto da Dimri et al. (1995) dimostrando che i fibroblasti umani senescenti hanno aumentato l’attività di SA-z-Gal se sono stati analisi al pH 6²³ rispetto alle cellule che proliferano. Nel frattempo, in vitro e in vivo sono stati stabiliti saggi per SA-z-Gal per diversi tipi di cellule e tessuti^25,39,40. Il metodo a …

Materials

DMEM	Corning	10-013-CV	medium
Ham's F10	Gibco	12390-035	medium
fetal bovine serum	Tissue Culture Biologics	101	serum
1x non-essential amino acids	Corning	25-025-Cl	amino-acids
bafilomycin A1	Sigma	B1793	lysosomal inhibitor
C12FDG	Setareh Biotech	7188	b-Gal substrate
Hoechst 33342	Life Technologies	H1399	DNA intercalation agent
17DMAG	Selleck Chemical LLC	50843	HSP90 inhibitor
InCell6000 Cell Imaging System	GE Healthcare		High Content Imaging System