Ensayo de cribado basado en sA-Galactosidasa para la identificación de medicamentos senoterapéuticos
Summary
La senescencia celular es el factor clave en el desarrollo de patologías crónicas relacionadas con la edad. La identificación de las terapias que se dirigen a las células senescentes son prometedoras para extender el envejecimiento saludable. Aquí, presentamos un nuevo ensayo para la identificación de senoterapéuticos basado en la medición de la actividad de senescencia asociada a la galactosidasa en células individuales.
Abstract
La senescencia celular es una de las señas de identidad del envejecimiento que se sabe que influye negativamente en una vida saludable. Los medicamentos capaces de matar las células senescentes específicamente en el cultivo celular, llamados snolíticos, pueden reducir la carga celular senescente in vivo y extender la vida sanitaria. Hasta la fecha se han identificado múltiples clases de sílíticos, incluidos los inhibidores del HSP90, los inhibidores de la familia Bcl-2, la piperlongumina, un péptido inhibidor de FOXO4 y la combinación de Dasatinib/Quercetina. La detección de SA-a-Gal a un pH lisosomal aumentado es uno de los marcadores mejor caracterizados para la detección de células senescentes. Mediciones de células vivas de la actividad de la senescencia asociada a la galactosidasa (SA–Gal) utilizando el sustrato fluorescente C12FDG en combinación con la determinación del número celular total utilizando un tinte Hoechst intercalado de ADN abre la posibilidad de detectar medicamentos senoterapéuticos que reducen la actividad general de la SA-A-Gal matando a células senescentes (senolíticas) o suprimiendo SA–Gal y otros fenotipos de células senescentes (senomórficas). El uso de una plataforma de adquisición y análisis de imágenes fluorescentes de alto contenido permite la detección rápida y de alto rendimiento de las bibliotecas de medicamentos en busca de efectos en SA-A-Gal, morfología celular y número de célula.
Introduction
La senescencia celular fue descrita por primera vez por Leonard Hayflick y Paul Moorhead,quienes mostraron que las células normales tenían una capacidad limitada para proliferar en el cultivo 1. Las células senescentes no proliferan a pesar de la presencia de nutrientes, factores de crecimiento y falta de inhibición del contacto, pero permanecen metabólicamente activas2. Este fenómeno se conoce como senescencia replicativa y se atribuyó principalmenteal acortamiento de los telómeros, al menos en las células humanas 3. Otros estudios han demostrado que las células también pueden ser inducidas para someterse a senescencia en respuesta a otros estímulos, como el estrés oncogénico (senescencia inducida por oncógeno, OIS), daño al ADN, fármacos citotóxicos o irradiación (senescencia inducida por estrés, SIS)4 , 5 , 6. En respuesta a daños en el ADN, incluida la erosión de los telómeros, las células se ensacian, inician el crecimiento celular incontrolado o se someten a apoptosis si el daño no puede ser reparado. En este caso, la senescencia celular parece ser beneficiosa ya que actúa de manera supresora tumoral2. Por el contrario, la senescencia aumenta con el envejecimiento debido a la acumulación de daño celular, incluyendo daño al ADN. Dado que las células senescentes pueden secretar citoquinas, metaloproteinasas y factores de crecimiento, denominaron fenotipo secretor asociado a la senescencia (SASP), este aumento dependiente de la edad en la senescencia celular y SASP contribuye a disminuir la homeostasis tisular y posteriormente envejecimiento. Además, este aumento dependiente de la edad en la carga de senescencia es conocido por inducir enfermedades metabólicas, sensibilidad al estrés, síndromes de progeria, y deterioro de la curación7,8 y es, en parte, responsable de los numerosos relacionados con la edad enfermedades, como aterosclerosis, osteoartritis, degeneración muscular, formación de úlceras, y enfermedad de Alzheimer9,10,11,12,13. La eliminación de las células senescentes puede ayudar a prevenir o retrasar la disfunción tisular y extender la vida saludable14. Esto se ha demostrado en los modelos de ratón transgénico14,15,16, así como mediante el uso de fármacos senolíticos y combinaciones de fármacos que se descubrieron a través de esfuerzos de detección de drogas y análisis bioinformáticos de vías inducidas específicamente en células senescentes17,18,19,20,21,22. Identificar fármacos senoterapéuticos más óptimos, capaces de reducir más eficazmente la carga celular senescente, es un paso importante en el desarrollo de enfoques terapéuticos para el envejecimiento saludable.
Las células senescentes muestran características fenotípicas y moleculares características, tanto en cultivo como in vivo. Estos marcadores de senescencia podrían ser la causa o el resultado de la inducción de la senescencia o un subproducto de los cambios moleculares en estas células. Sin embargo, no se encuentra un solo marcador específicamente en las células senescentes. En la actualidad, la detección de la galactosidasa asociada a la senescencia (SA-Gal) es uno de los métodos basados en células únicas mejor caracterizados y establecidos para medir la senescencia in vitro e in vivo. Es una hidrolasa lisosomal con una actividad enzimática óptima a pH 4. Medir su actividad a pH 6 es posible porque las células senescentes muestran un aumento de la actividad lisosomal23,24. Para las células vivas, el aumento del pH lisosomal se obtiene mediante alcalinización lisosomal con el inhibidor vacuolar H+-ATPase Bafilomicina A1 o el inhibidor de la acidificación endosomal cloroquina25,26. 5-DodecanoylaminofluoresceinDi-o-D-galactopyraside (C12FDG) se utiliza como sustrato en células vivas ya que retiene el producto de linaza en las células debido a su 12 mitades lipofílicas de carbono25. Es importante destacar que la actividad de SA-A-Gal en sí misma no está directamente relacionada con ninguna vía identificada en las células senescentes y no es necesaria para inducir la senescencia. Con este ensayo, las células senescentes se pueden identificar incluso en las poblaciones de células heterogéneas y tejidos envejecidos, como biopsias de piel de individuos mayores. También se ha utilizado para mostrar una correlación entre la senescencia celular y el envejecimiento23 ya que es un marcador fiable para la detección de células senescentes en varios organismos y condiciones27,28,29, 30. En este caso, se describe un ensayo de cribado de alto rendimiento sA-a-Gal basado en el sustrato fluorescente C12FDG utilizando fibroblastos embrionarios de ratón primario (MEF) con senescencia celular inducida por estrés oxidativo robusto y sus ventajas y desventajas se discuten. Aunque este ensayo se puede realizar con diferentes tipos de células, el uso de Ercc1-insuficiente, DETERIORO de la reparación del ADN MEFs permite una inducción más rápida de la senescencia en condiciones de estrés oxidativo. En ratones, la reducción de la expresión de la endonucleasa de reparación del ADN ERCC1-XPF causa deterioro de la reparación del ADN, acumulación acelerada de daño endógeno del ADN, ROS elevado, disfunción mitocondrial, aumento de la carga celular senescente, pérdida de la función de las células madre y envejecimiento prematuro, similar al envejecimiento natural31,32. Del mismo modo, los MEF con deficiencia de Ercc1sufren senescencia más rápidamente en el cultivo17. Una característica importante del ensayo MEF senescente es que cada pozo tiene una mezcla de células senescentes y no senescentes, lo que permite la demostración clara de efectos específicos de células senescentes. Sin embargo, aunque creemos que el uso del estrés oxidativo en las células primarias para inducir la senescencia es más fisiológico, este ensayo también se puede utilizar con líneas celulares donde la senescencia se induce con agentes dañinos para el ADN como la etoposido o la irradiación.
Protocol
Representative Results
Discussion
Es un biomarcador bien definido para la senescencia celular descubierto originalmente por Dimri et al. (1995) mostrando que los fibroblastos humanos senescentes han aumentado la actividad de SA-a-Gal cuando se analizan a pH 623 en comparación con las células que proliferan. Mientras tanto, se han establecido ensayos in vitro e in vivo para SA-a-Gal para diferentes tipos de células y tejidos25,39,40<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por NIH Grants AG043376 (Proyecto 2 y Núcleo A, PDR; Proyecto 1 y Core B, LJN) y AG056278 (Proyecto 3 y Núcleo A, PDR; y Proyecto 2, LJN) y una subvención de la Fundación Glenn (LJN).
Materials
| DMEM | Corning | 10-013-CV | medium |
| Ham's F10 | Gibco | 12390-035 | medium |
| fetal bovine serum | Tissue Culture Biologics | 101 | serum |
| 1x non-essential amino acids | Corning | 25-025-Cl | amino-acids |
| bafilomycin A1 | Sigma | B1793 | lysosomal inhibitor |
| C12FDG | Setareh Biotech | 7188 | b-Gal substrate |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H1399 | DNA intercalation agent |
| 17DMAG | Selleck Chemical LLC | 50843 | HSP90 inhibitor |
| InCell6000 Cell Imaging System | GE Healthcare | High Content Imaging System |
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