조 혈 줄기 세포 이식 Myelodysplastic 증후군의 평가에 사용

요약

우리는 유전자 조작된 조 혈 모 세포의 악성 잠재력을 평가 하기 위해 조 혈 모 세포 이식 (HSCT)의 사용을 설명 합니다. HSCT 소설 치료를 평가 하 형성 증후군 (MDS) 또는 백혈병 생쥐의 대형 코 호트 생성 뿐만 아니라 다양 한 악성 조 혈 모 세포에 vivo에서 평가 대 한 유용 합니다.

초록

형성 증후군 (MDS) 효과 조, 말 초 혈액 cytopenias, 발육 이상, 급성 백혈병에 변환에 대 한 성향에 의해 정의 되는 조 혈 줄기 세포 장애의 다양 한 그룹입니다. NUP98-HOXD13 (NHD13) 유전자 변형 마우스 주변 혈액 cytopenias, 발육 이상, 및 급성 백혈병 변환 인적 MDS 정리. 우리는 이전는 MDS 옮겨질 수 있었다 MDS와 유전자 조작된 마우스에서 야생-타입 받는 사람에 게 이식 MDS 골 nucleated 세포 (BMNC)에 의해 설명 했다. 더 명확 하 게 근원의 MDS 셀 이해, 특정 이식 하는 방법을 개발 했습니다, 그리고 immunophenotypically 조 혈 하위 집합을 정의 합니다. 이 문서에서 우리는 분리 하 고 조 혈 줄기와 조상 세포의 특정 인구를 이식 하는 과정을 설명 합니다. 따라 이식, 이식의 효율성 및 기증자 MDS 셀의 지 속성을 평가 하는 방법 설명 합니다.

서론

형성 증후군 (MDS) 대표 클론 혈액 장애 효과 조, 발육 이상의 morphologic 증거 및 급성 골수성 백혈병 (AML)^{1,2로 변환에 대 한 성향 특징의 다양 한 세트 ,,34}. 효과 조 골 수에서 성숙 체포 및 hypercellular 골^1,3에 불구 하 고 주변 혈액 cytopenias 결과 인식 됩니다. MDS의 발병 률 각종 2-12의 경우는 미국에서 매년 100, 000 명 당으로 추정 하 고 MDS의 발병 률 증가 나이, 노화 미국 인구^{3, 주어진 이해 하는 중요 한 조건 만들기 5}. MDS의 대부분의 경우는 더 명확한 병 인, MDS의 경우 벤젠, 그리고 암 화학요법⁶같은 용 매를 포함 하 여 알려진된 차적인 에이전트에 노출 때문에 생각 된다.

프로토콜

이 문서에서 설명 하는 동물 절차 베 데스 다 동물 관리 및 사용 위원회, 국립 암 연구소에 의해 승인 했다 그리고 인간적 관심과 실험실 동물의 사용에는 공중 보건 서비스 정책에 포함 된 정책 준수는 동물 복지 행위, 그리고 관리 및 실험 동물의 사용에 대 한 가이드.

1. 세포 준비

1. 수확 골 nucleated 세포 (BMNC)
   1. 메 마른 재료만을 사용 합니다. 소독 증기 압력솥을 사용 하 여 다시 사용할 수 있는 악기. 바늘, 주사기, 그리고 단일 사용 무 균 용기에 플라스틱 도자기를 구입. 유형 a 2 생물 안전 캐비닛 클래스 II에서 모든 동물 및 세포 조작을 수행 합니다.
   2. HF2 3 mL를 포함 하는 하단 튜브 라운드 14 ml에서 BMNCs 준비 (행 크의 균형 소금 솔루션 2% 태아 둔감 한 혈 청으로 보충).
   3. C57Bl6 기증자 쥐 (CD45 대립 유전자 CD45.2에 대 한 긍정적인), 일반적으로 2-6 개월, 나이 CO₂ 챔버를 사용 하 여 안락사
   4. 스프레이 병으로 몸 전체에 70% 에탄올을 분사 하 여 마우스 시체를 소독. 발목 아래로 골반에서 다리에서 피부를 벗 겨.
   5. 살 균 (직선, 샤 프/샤 프,....

결과

우리는 몇 가지 실험의 결과 대 한 대표적인 수치를 보여줍니다. 그림 1 실험 정렬 대표 cytometry를 보여준다. 정상적인 조 혈 차별화, 동안 세포가 특정 조 혈 혈통에 최선을 다하고 그들은 혈통 정의 세포 표면 마커를 확보 고 자기 갱신에 대 한 가능성을 잃게. 따라서, 야생-타입 마우스, 줄기 세포 자체-갱신은 혈통 부정적인 BMNC에 국한. 이 실험에서 우리 혈통-부정, 낮은 혈통 긍정적인, 그리고 높은 혈통 양성 세포로 NHD13 골 수에서 BMNC 정렬. 이러한 정렬 셀 다음 자기 갱신 용량을 확인 받는 사람 WT에 이식 했다.

그림 2 는 별도 실험에서 결과 혈통에 부정적인 세포 또는 MDS와 NHD13 기증자에서 정렬 되지 않은 셀 치명적.......

토론

MDS는 클론 조 혈 줄기 세포 장애, MDS "줄기", 또는 시작 셀 특징 되었습니다 아직 없습니다. 우리는 이전 MDS transplantable WT 쥐 HSCT, macrocytic 빈혈증, leukopenia, 호 중구 감소 증, 그리고 발육 이상¹⁵의 morphologic 증거 특징에 의해 NHD13 쥐에서 골 수를 사용 하 여 될 수 있는 시연 했다. 또한, 경쟁력 있는 repopulation 분석 NHD13 MDS 골 수에서 세포의 성장 우위를 확인. 함께 찍은, 이러한 결과 MDS 줄기 또는 시작 셀의 존재 의미. 추가 실험은 진행 중인 지금,는 immunophenotypic 정제 목적으로 시작 하는 MDS의 특성¹⁵ 더 정의 된 줄기와 조상 세포 마커 (CD150, CD48, c-Kit 및 Sca 1)를 사용 하 여¹⁶ 계보와 결합 마커 얼룩이 프로토콜에서 설명 하는 방법입니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
14 mL 라운드 바닥 튜브	Falcon	352057
Hank's balanced salt solution	Lonza	10-527F
Anti-CD45.2 항체	Southern Biotech	1800-15	LOT# A077-T044O
3 mL 주사기	Monoject	8881513934
27-G 바늘	BD	305109
20-G 바늘	BD
305176 Lineage Cocktail	Miltenyi	130-090-858	LOT# 5170418221
Anti-Biotin 항체	Miltenyi	130-113-288	LOT#
5171109046 1 mL 주사기	Excelint	26027	인슐린 주사기
가열 램프	Thermo Fisher Scientific	E70001901
FACS 기계	Cytec	FACScan	2 레이저, 5개의 색 검출기
FACS 선별 기기	Beckman Coulter	MOFLO ASTRIOS	5개의 레이저, 23개의 매개변수, 6개의 집단 동시 분류
프로피듐 요오드화물	Thermo Fisher Scientific	P3566
감마 조사기	최고의 테라트로닉스	감마셀 40
혈액 채취관	RAM scientific	76011
수상자 마우스	Charles River	B6-LY5.1/Cr, CD45.1
NUP98-HOXD13 마우스	n/a	C57Bl/6, CD45.2	Colony maintained at NIH
5 mL round bottom tube	Falcon	352058