Luminophore formatie in verschillende conformaties van bovien serumalbumine door Binding van Gold(III)
Summary
De protocollen voor het bestuderen van de binding van gouden kationen (Au(III)) naar verschillende conformaties van bovien serumalbumine (BSA) zoals alsook voor het karakteriseren van de conformationele afhankelijke unieke BSA-Au fluorescentie worden gepresenteerd.
Abstract
Het doel van de voorgestelde protocollen is te bestuderen van het proces van Au(III) binding aan BSA, opbrengst conformatie verandering-geïnduceerde rode fluorescentie (λem = 640 nm) van BSA-Au(III) complexen. De methode past de pH om te laten zien dat de opkomst van de rode fluorescentie is gecorreleerd met de pH-geïnduceerde evenwicht overgangen van de BSA conformaties. Rode fluorescerende BSA-Au(III) complexen kunnen alleen worden gevormd met een aanpassing van de pH op of boven 9.7, die overeenkomt met de “A-poot” conformatie van BSA. Het protocol voor aanpassen van de BSA Au molaire verhouding en het controleren van het tijdsverloop van het proces van Au(III) binding wordt beschreven. Het minimum aantal Au(III) per BSA, voor de productie van de rode fluorescentie, is minder dan zeven. We beschrijven het protocol in stappen om te illustreren de aanwezigheid van meerdere Au(III) bandplaatsen in BSA. Eerste, door toevoeging van koper (Cu(II)) of nikkel (Ni(II)) caties gevolgd door Au(III), deze methode blijkt een bindende site voor Au(III) thats niet de rode fluorophore. Ten tweede, door aanpassing van BSA door thiol aftopping agenten, een andere nonfluorophore-vormende Au(III) bindende site wordt geopenbaard. Ten derde, het veranderen van de gedaante BSA door splijten en de aftopping van de disulfide bindingen, de (s) van de mogelijke Au(III)-bindende worden geïllustreerd. Het protocol beschreven, als u wilt bepalen van de BSA conformaties en Au(III) bindende, kan over het algemeen worden toegepast om te bestuderen van de interacties van de andere eiwitten en metalen caties.
Introduction
Een verbinding van de BSA-Au exposeren een ultraviolet (UV)-prikkelbaar rode fluorescentie, met opmerkelijke verschuiving stokes, heeft zijn oorspronkelijk gesynthetiseerd door Xie et al.. 1. de unieke en stabiele rode fluorescentie vindt verschillende applicaties op gebieden zoals sensing2,3,4, imaging5,6,7, of nanogeneeskunde8 ,9,10,11,12,13. Deze verbinding is uitgebreid bestudeerd door vele onderzoekers op het gebied van nano-wetenschap in de afgelopen jaren14,15,16. De BSA-Au-compound is geïnterpreteerd als Au25 nanoclusters. Het doel van de onderhavige methode is deze compound in detail onderzoeken en begrijpen van de oorsprong van de rode fluorescentie. Door het volgen van de gepresenteerde aanpak, kunnen de aanwezigheid van meerdere Au bandplaatsen, en de oorsprong van de fluorescentie, alternatief voor de nucleatie van één site van Au25 nanoclusters, worden geïllustreerd. Dezelfde aanpak kan worden gebruikt om te bestuderen hoe andere eiwitten17,18,19 complexvorm met Au(III) hun intrinsieke fluorescerende eigenschappen kunt wijzigen.
De synthese van het rood-fluorescerende BSA-Au samengestelde vereist een smalle controle van de molaire verhoudingen van BSA aan Au (BSA:Au) om de intensiteit van de fluorescentie en de locatie van de pieken in de excitatie-emissie kaart (EEM)20te maximaliseren. Kan worden aangetoond dat er meerdere bandplaatsen bestaan voor Au(III) te binden, met inbegrip van de Asparagine fragment (of ASP-fragment, de eerste vier aminozuurresidu’s op de N-terminus van BSA)21,22. De 34th aminozuur van BSA (Cys-34) blijkt ook te coördineren van Au(III) en te worden betrokken in het mechanisme van de rode fluorescence([Cys34-capped-BSA]-Au(III))20. Op het splijten van alle Cys-Cys disulfide bindingen en aftopping alle thiolen, rode fluorescentie is niet geproduceerd ([all-thiol-capped-BSA]-Au(III)). Dit wijst op de noodzaak van Cys-Cys bisulfide obligaties als de Au(III) binding site voor de productie van de rode fluorescentie.
Eiwit chemie technieken hebben niet wijd gebruikt om te studeren het BSA-Au(III) complexen in de nano-wetenschappelijke gemeenschap. Het zou echter waardevolle om deze technieken te begrijpen van bepaalde aspecten van deze complexen, alsook over de gedetailleerde inzicht voor de Au(III) bandplaatsen in BSA in dienst. Dit artikel is bedoeld om te laten zien dat sommige van deze technieken.
Protocol
Representative Results
Discussion
De verbindingen van de BSA-Au(III) bereid met een pH van 12 vertonen rode fluorescentie bij een golflengte van de emissie van λem= 640 nm wanneer opgewonden met ultraviolet (UV) licht λex= 365 nm (figuur 1A). De opkomst van rode fluorescentie is een langzaam proces en duurt een paar dagen bij kamertemperatuur te verhogen tot een maximale intensiteit. Uitvoeren van de reactie bij 37 ° C zal de optimale resultaten opleveren, hoewel hogere temperatuur kan worde…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
S.E. erkent de steun van hertog Endowment speciaal initiatief Fonds, Wells Fargo Fonds, PhRMA Foundation, evenals opstarten middelen van de Universiteit van North Carolina, Charlotte.
Materials
| Bovine Serum Albumin (BSA), 96% | Sigma-Aldrich | A5611 | |
| gold (III) chloride trihydrate, 99.9% | Sigma-Aldrich | 520918 | |
| Copper (II) chloride dihydrate, 99.999% | Sigma-Aldrich | 459097 | |
| Nickel (II) chloride hexahydrate, 99.9% | Sigma-Aldrich | 654507 | |
| N-Ethylmaleimide (NEM), >99.0% | Sigma-Aldrich | 4259 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP), >98.0% | Sigma-Aldrich | C4706 | |
| Sodium hydroxide, >98.0% | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Urea, 99.5% | Chem-Implex Int'l | 30142 | |
| Phospate buffered saline (PBS) | Corning | MT21040CV | |
| Ammonium bicarbonate, 99.5% | Sigma-Aldrich | 9830 |
References
- Xie, J., Zheng, Y., Ying, J. Y. Protein-Directed Synthesis of Highly Fluorescent Gold Nanoparticles. Journal of the American Chemical Society. 131, 888-889 (2009).
- Saha, K., Agasti, S. S., Kim, C., Li, X., Rotello, V. M. Gold Nanoparticles in Chemical and Biological Sensing. Chemical Reviews. 112, 2739-2779 (2012).
- Zhang, Y., et al. New Gold Nanostructures for Sensor Applications: A Review. Materials. 7, 5169-5201 (2014).
- Chen, L. -. Y., Wang, C. -. W., Yuan, Z., Chang, H. -. T. Fluorescent Gold Nanoclusters: Recent Advances in Sensing and Imaging. Analytical Chemistry. 87 (1), 216-229 (2015).
- Cai, W., Gao, T., Hong, H., Sun, J. Applications of Gold Nanoparticles in Cancer Nanotechnology. Nanotechnology, Science and Applications. 1, 17-32 (2008).
- Nune, S. K., et al. Nanoparticles for Biomedical Imaging. Expert Opinion on Drug Delivery. 6, 1175-1194 (2009).
- Dorsey, J. F., et al. Gold Nanoparticles in Radiation Research: Potential Applications for Imaging and Radiosensitization. Translational Cancer Research. 2, 280-291 (2013).
- Daniel, M. -. C., Astruc, D. Gold Nanoparticles: Assembly, Supramolecular Chemistry, Quantum-Size-Related Properties, and Applications toward Biology, Catalysis, and Nanotechnology. Chemical Reviews. 104 (1), 293-346 (2004).
- Ferrari, M. Cancer Nanotechnology: Opportunities and Challenges. Nature Reviews Cancer. 5, 161-171 (2005).
- Huang, X., Jain, P. K., El-Sayed, I. H., El-Sayed, M. A. Gold Nanoparticles: Interesting Optical Properties and Recent Applications in Cancer Diagnostics and Therapy. Nanomedicine. 2, 681 (2007).
- Arvizo, R., Bhattacharya, R., Mukherjee, P. Gold Nanoparticles: Opportunities and Challenges in Nanomedicine. Expert Opinion on Drug Delivery. 7, 753-763 (2010).
- Doane, T. L., Burda, C. The Unique Role of Nanoparticles in Nanomedicine: Imaging, Drug Delivery and Therapy. Chemical Society Reviews. 41, 2885 (2012).
- Egusa, S., Ebrahem, Q., Mahfouz, R. Z., Saunthararajah, Y. Ligand Exchange on Gold Nanoparticles for Drug Delivery and Enhanced Therapeutic Index Evaluated in Acute Myeloid Leukemia Models. Experimental Biology and Medicine. 239, 853 (2014).
- Qu, X., et al. Fluorescent Gold Nanoclusters: Synthesis and Recent Biological Application. Journal of Nanomaterials. (784097), (2015).
- Chakraborty, I., Pradeep, T. Atomically Precise Clusters of Noble Metals: Emerging Link between Atoms and Nanoparticles. Chemical Reviews. 117, 8208-8271 (2017).
- Raut, S., et al. Evidence of energy transfer from tryptophan to BSA/HSA protected gold nanoclusters. Methods and Applications in Fluorescence. 2, (2014).
- Le Guével, X., Daum, N., Schneider, M. Synthesis and Characterization of Human Transferrin-Stabilized Gold Nanoclusters. Nanotechnology. 22 (27), (2011).
- Kawasaki, H., Yoshimura, K., Hamaguchi, K., Arakawa, R. Trypsin-Stabilized Fluorescent Gold Nanocluster for Sensitive and Selective Hg2+ Detection. Analytical Sciences. 27 (6), 591 (2011).
- Lu, D., et al. Lysozyme-Stabilized Gold Nanoclusters as a Novel Fluorescence Probe for Cyanide Recognition. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 121, 77-80 (2014).
- Dixon, J. M., Egusa, S. Conformational Change-Induced Fluorescence of Bovine Serum Albumin-Gold Complexes. Journal of the American Chemical Society. 140, 2265-2271 (2018).
- Peters, T. . All About Albumin. , (1996).
- Masuoka, J., Saltman, P. Zinc(II) and Copper(II) Binding to Serum Albumin. A Comparative Study of Dog, Bovine, and Human Albumin. Journal of Biological Chemistry. 269, 25557-25561 (1994).
- Takeda, K., Wada, A., Yamamoto, K., Moriyama, Y., Aoki, K. Conformational Change of Bovine Serum Albumin by Heat Treatment. Journal of Protein Chemistry. 8 (5), 653-659 (1989).
- Klotz, I. M., Curme, H. G. The Thermodynamics of Metallo-protein Combinations. Copper with Bovine Serum Albumin. Journal of the American Chemical Society. 70, 939-943 (1948).
- Fiess, H. A., Klotz, I. M. The Thermodynamics of Metallo-Protein Combinations. Comparison of Copper Complexes with Natural Proteins. J. Am. Chem. Soc. 74, 887-891 (1952).
- Rao, M. S. N. A Study of the Interaction of Nickel(II) with Bovine Serum Albumin. Journal of the American Chemical Society. 84, 1788-1790 (1962).
- Peters, T., Blumenstock, F. A. Copper-Binding Properties of Bovine Serum Albumin and Its Amino-terminal Peptide Fragment. Journal of Biological Chemistry. 242, 1574-1578 (1967).
- Xue, Y., Li, X., Li, H., Zhang, W. Quantifying Thiol-Gold Interactions towards the Efficient Strength Control. Nature Communications. 5, 4348 (2014).
- Xu, Y., et al. The Role of Protein Characteristics in the Formation and Fluorescence of Au Nanoclusters. Nanoscale. 6 (3), 1515-1524 (2014).
