Luminophore formazione in varie conformazioni di albumina di siero bovino di legame dell'oro
Summary
I protocolli per studiare l’associazione di oro cationi (Au(III)) a varie conformazioni di albumina di siero bovino (BSA) come pure per caratterizzare la fluorescenza di BSA-Au unica dipendente conformazionale sono presentati.
Abstract
Lo scopo dei protocolli presentati è quello di studiare il processo di associazione Au(III) a BSA, cedendo la fluorescenza rossa indotta da cambiamento di conformazione (λem = 640 nm) dei complessi BSA-Au(III). Il metodo consente di regolare il pH per mostrare che l’emersione della fluorescenza rossa è correlato con le transizioni di equilibrio pH-indotta delle conformazioni BSA. Rosso fluorescente BSA-Au(III) complessi possono essere formati solo con un adeguamento del pH pari o superiore a 9.7, che corrisponde alla conformazione “A-form” di BSA. Il protocollo per regolare la BSA al rapporto molare Au e per monitorare il corso di tempo del processo di associazione Au(III) è descritto. Il numero minimo di Au(III) a BSA, per produrre la fluorescenza rossa, è meno di sette. Descriviamo il protocollo nei passaggi per illustrare la presenza di più siti di legame di Au(III) in BSA. Prima, con l’aggiunta di rame (Cu(II)) o nichel (cationi Ni(II)) seguiti da Au(III), questo metodo si rivela un sito di legame per Au(III) che non è il fluoroforo rosso. In secondo luogo, modificando tiolo tappatura agenti BSA, viene rivelato un altro sito di legame di Au(III) nonfluorophore-formanti. In terzo luogo, i dominî di BSA di sfaldatura e tappatura dei legami disolfuro, sono illustrati i possibili siti di associazione Au(III). Il protocollo descritto, per controllare le conformazioni di BSA e l’associazione Au(III), può essere generalmente applicato per studiare le interazioni di altre proteine e cationi metallici.
Introduction
Un composto di BSA-Au esibendo un ultravioletto (UV)-eccitabile fluorescenza rossa, con notevole spostamento di stokes, è stato originariamente sintetizzato da Xie et al. 1. la fluorescenza rossa univoco e stabile può trovare varie applicazioni in campi quali rilevamento2,3,4,5,6,7o imaging nanomedicina8 ,9,10,11,12,13. Questo composto è stato studiato estesamente da molti ricercatori nel campo delle nano-scienze in ultimi anni14,15,16. Il composto di BSA-Au è stato interpretato come Au25 nanocluster. L’obiettivo del metodo presentato è per esaminare questo composto in dettaglio e per capire l’origine della fluorescenza rossa. Seguendo l’approccio presentato, la presenza di più siti di legame di Au e l’origine della fluorescenza, alternativa per la nucleazione di singolo sito di nanocluster di Au25 , possono essere illustrate. Lo stesso approccio può essere impiegato per studiare come altre proteine17,18,19 complessato con Au(III) può cambiare le loro proprietà intrinseche, fluorescente.
La sintesi del composto rosso fluorescente BSA-Au richiede un controllo stretto dei rapporti molari di BSA per Au (BSA:Au) per massimizzare l’intensità della fluorescenza e la posizione dei picchi a eccitazione-emissione mappa (EEM)20. Si può dimostrare che più siti di legame esistano per Au(III) per l’associazione, tra cui il frammento di asparagina (o frammento di Asp, i primi quattro residui dell’amminoacido al N-terminale di BSA)21,22. Dell’aminoacidoth 34 di BSA (Cys-34) è inoltre indicato per coordinare Au(III) e di essere coinvolti nel meccanismo del rosso fluorescence([Cys34-capped-BSA]-Au(III))20. Su tutti i ponti disolfuro Cys Cys di sfaldatura e tappatura tutti fluorescenza di tioli, rosso non è prodotta ([all-thiol-capped-BSA]-Au(III)). Questo indica la necessità di legami disolfuro Cys Cys come il sito di legame di Au(III) per produrre la fluorescenza rossa.
Tecniche di chimica della proteina non sono stati ampiamente utilizzati per studiare i complessi di BSA-Au(III) della comunità di nano-scienza. Tuttavia, sarebbe prezioso per impiegare queste tecniche per capire alcuni aspetti di questi complessi, nonché di acquisire una comprensione dettagliata delle sedi del legame di Au(III) in BSA. Questo articolo è destinato a mostrare alcune di queste tecniche.
Protocol
Representative Results
Discussion
I composti di BSA-Au(III) preparati a pH 12 presentano fluorescenza rossa ad una lunghezza d’onda di emissione di λem= 640 nm quando eccitato con raggi ultravioletti (UV) luce λex= 365 nm (Figura 1A). L’emergere di fluorescenza rossa è un processo lento e avrà un paio di giorni a temperatura ambiente per aumentare a un’intensità massima. In esecuzione della reazione a 37 ° C produrrà i risultati ottimali, anche se alta temperatura può essere utilizzato …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
S.E. riconosce il sostegno dal fondo di Duke dotazione speciale iniziativa, fondo di Wells Fargo, PhRMA Foundation, nonché avvio fondi presso la University of North Carolina, Charlotte.
Materials
| Bovine Serum Albumin (BSA), 96% | Sigma-Aldrich | A5611 | |
| gold (III) chloride trihydrate, 99.9% | Sigma-Aldrich | 520918 | |
| Copper (II) chloride dihydrate, 99.999% | Sigma-Aldrich | 459097 | |
| Nickel (II) chloride hexahydrate, 99.9% | Sigma-Aldrich | 654507 | |
| N-Ethylmaleimide (NEM), >99.0% | Sigma-Aldrich | 4259 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP), >98.0% | Sigma-Aldrich | C4706 | |
| Sodium hydroxide, >98.0% | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Urea, 99.5% | Chem-Implex Int'l | 30142 | |
| Phospate buffered saline (PBS) | Corning | MT21040CV | |
| Ammonium bicarbonate, 99.5% | Sigma-Aldrich | 9830 |
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