Lumíforo formação em várias conformações de albumina de soro bovino por ligação de Gold(III)

Summary

Os protocolos para estudar a ligação de ouro cátions (Au(III)) para várias conformações de albumina de soro bovino (BSA), bem como para caracterizar a fluorescência de BSA-Au única dependente conformacional são apresentadas.

Abstract

O objetivo dos protocolos apresentados é estudar o processo de ligação de Au(III) a BSA, rendendo fluorescência vermelha induzida pela mudança de conformação (λ_em = 640 nm) de complexos de BSA-Au(III). O método ajusta o pH para mostrar que o surgimento da fluorescência vermelha está correlacionado com as transições de equilíbrio de pH-induzida de conformações da BSA. Fluorescente vermelha BSA-Au(III) complexos só podem ser formados com um ajuste de pH igual ou superior a 9,7, que corresponde a conformação de “Uma-forma” da BSA. O protocolo para ajustar a BSA a razão molar de Au e para monitorar o tempo-curso do processo de vinculação de Au(III) é descrito. O número mínimo de Au(III) por BSA, para produzir a fluorescência vermelha, tem menos de sete anos. Descrevemos o protocolo em etapas para ilustrar a presença de vários sites de ligação Au(III) em BSA. Primeiro, pela adição de cobre (Cu(II)) ou níquel (Ni(II)) cações seguidas por Au(III), este método revela um sítio de ligação para Au(III) que não é o fluoróforo vermelho. Em segundo lugar, modificando BSA tiol tampando agentes, outro sítio de ligação de Au(III) nonfluorophore-formando é revelado. Em terceiro lugar, alterando a conformação de BSA por clivagem e nivelamento das ligações de bissulfeto, Au(III) possível ligação site é ilustrado. O protocolo descrito, para controlar as conformações de BSA e Au(III) ligação, pode ser aplicado geralmente para estudar as interações de outras proteínas e cátions metálicos.

Introduction

Um composto de BSA-Au exibindo uma radiação ultravioleta (UV)-fluorescência vermelha excitável, com notável stokes turno, tem sido sintetizado originalmente por Xie et al. ¹. a fluorescência vermelha única e estável pode encontrar várias aplicações em campos como a detecção de^3,2,4, imagem^5,6,7ou nanomedicina^{8 ,9,10,11,12,13}. Este composto tem sido estudado extensivamente por muitos pesquisadores no campo da nano-ciência em anos recentes^14,15,16. O composto de BSA-Au tem sido interpretado como Au₂₅ nanoclusters. O objetivo do método apresentado é para examinar este composto em detalhe e para compreender a origem da fluorescência vermelha. Seguindo a abordagem apresentada, a presença de vários sites de ligação do Au e a origem da fluorescência, alternativa para a nucleação de single-site de Au₂₅ nanoclusters, podem ser ilustrados. A mesma abordagem pode ser utilizada para estudar como outras proteínas^17,18,19 complexado com Au(III) pode alterar suas propriedades intrínsecas, fluorescentes.

A síntese do composto fluorescente vermelha BSA-Au requer um controle estreito dos rácios molares da BSA para Au (BSA:Au) para maximizar a intensidade da fluorescência e a localização dos picos a excitação-emissão de mapa (EEM)²⁰. Pode-se demonstrar que vários sites de vinculação existem para Au(III) vincular, incluindo o fragmento de asparagina (ou fragmento de Asp, os primeiro de quatro resíduos de aminoácidos no N-terminal da BSA)^21,22. O aminoácido 34^th de BSA (Cys-34) também é mostrado para coordenar Au(III) e de estar envolvido no mecanismo do fluorescence([Cys34-capped-BSA]-Au(III)) vermelho²⁰. Fendendo a todas as ligações de bissulfeto Cys-Cys e tampando todos fluorescência de tióis, vermelho não é produzido ([all-thiol-capped-BSA]-Au(III)). Isto indica a necessidade de ligações de bissulfeto Cys-Cys como o sítio de ligação do Au(III) para produzir a fluorescência vermelha.

Técnicas de química de proteínas não foram amplamente utilizadas para estudar os complexos de BSA-Au(III) na Comunidade de nano-ciência. No entanto, é importante empregar estas técnicas para entender alguns aspectos destes complexos, bem como para obter uma compreensão detalhada dos locais de ligação Au(III) da BSA. Este artigo pretende mostrar algumas dessas técnicas.

Protocol

1. síntese do complexo de BSA-Au(III) Dissolva 25 mg de BSA em 1 mL de água de grau de cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) em um frasco de reação de 5 mL.Nota: A solução deve aparecer claramente. Dissolva o ouro (III) cloreto trihidrato (ácido chloroauric) a uma concentração de 5 mM em água de grau HPLC.Nota: A solução deve aparecer amarela. Solução de Ácido cloroáurico preparada nessa concentração resultará em uma BSA, à relação entre Au 01:13. Em al…

Representative Results

De fluorescência do complexo BSA-Au(III), tem sido observado que a conversão da fluorescência azul intrínseca de BSA (λem = 400 nm) para fluorescência vermelha (λem = 640 nm) ocorre no sobre pH 9,7 através de um equilíbrio transição (Figura 1). EEM de BSA-Au(III) no BSA diferente rácios molar Au é mostrado na Figura 2, e esses dados mostram como alterar as proporções molares …

Discussion

Os compostos de BSA-Au(III) preparados em pH 12 apresentam fluorescência vermelha em um comprimento de onda de emissão de λ_em= 640 nm quando excitadas com ultravioleta (UV) luz λ_ex= 365 nm (figura 1A). O aparecimento de fluorescência vermelha é um processo lento e levará alguns dias à temperatura ambiente para aumentar a uma intensidade máxima. Executando a reação a 37 ° C irá produzir os melhores resultados, apesar de temperatura mais elevada pode…

Materials

Bovine Serum Albumin (BSA), 96%	Sigma-Aldrich	A5611
gold (III) chloride trihydrate, 99.9%	Sigma-Aldrich	520918
Copper (II) chloride dihydrate, 99.999%	Sigma-Aldrich	459097
Nickel (II) chloride hexahydrate, 99.9%	Sigma-Aldrich	654507
N-Ethylmaleimide (NEM), >99.0%	Sigma-Aldrich	4259
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP), >98.0%	Sigma-Aldrich	C4706
Sodium hydroxide, >98.0%	Sigma-Aldrich	S8045
Urea, 99.5%	Chem-Implex Int'l	30142
Phospate buffered saline (PBS)	Corning	MT21040CV
Ammonium bicarbonate, 99.5%	Sigma-Aldrich	9830