Luminophore formación en diversas conformaciones de albúmina sérica bovina mediante la Unión de Gold(III)
Summary
Los protocolos para el estudio de la Unión de cationes oro (Au(III)) a diversas conformaciones de albúmina de suero bovino (BSA), así como para caracterizar la conformacional dependiente única BSA-Au de la fluorescencia se presentan.
Abstract
El propósito de los protocolos presentados es estudiar el proceso de unión de Au(III) a BSA, produciendo fluorescencia roja inducida por el cambio de conformación (λem = 640 nm) de complejos BSA-Au(III). El método ajusta el pH para mostrar que la aparición de la fluorescencia roja se correlaciona con las transiciones inducidas por el pH de equilibrio de las conformaciones de BSA. Complejos de BSA-Au(III) fluorescentes rojo sólo pueden ser formadas con un ajuste del pH o por encima de 9.7, que corresponde a la conformación de la “Forma” de BSA. Se describe el protocolo para ajustar la BSA a fracción molar de Au y para monitorear el curso del tiempo del proceso de unión de Au(III). El número mínimo de Au(III) por BSA, para producir la fluorescencia roja, es menos de siete. Describimos el protocolo en pasos para ilustrar la presencia de múltiples sitios de unión de Au(III) en BSA. Primero, mediante la adición de cobre (Cu(II)) o níquel (Ni(II)) cationes seguidos de Au(III), este método revela un sitio de Unión para Au(III) que no es el fluoróforo rojo. En segundo lugar, modificando BSA por tiol agentes de recubrimiento, se revela otro sitio de unión de Au(III) de formación nonfluorophore. En tercer lugar, cambiando la conformación de BSA hendiendo y nivelación de los enlaces de disulfuro, se ilustra el posible sitio de Unión Au(III). El protocolo descrito, para controlar la conformaciones de BSA y el enlace de Au(III), puede aplicarse generalmente para estudiar las interacciones de proteínas y cationes del metal.
Introduction
Un compuesto de BSA-Au exhibiendo una radiación ultravioleta (UV)-excitable fluorescencia roja, con notable cambio de stokes, ha sido sintetizado originalmente por Xie et al. 1. la fluorescencia rojo única y estable puede encontrar diversas aplicaciones en campos tales como la detección de2,3,4, imagen5,6,7o nanomedicina8 ,9,10,11,12,13. Este compuesto ha sido estudiado ampliamente por muchos investigadores en el campo de la nano-ciencia en los últimos años14,15,16. El compuesto de Au de BSA ha sido interpretado como Au25 nanoclusters. El objetivo del método presentado es examinar este compuesto detalladamente y entender el origen de la fluorescencia roja. Siguiendo el enfoque presentado, se pueden ilustrar la presencia de múltiples sitios de unión de Au y el origen de la fluorescencia, alternativa a la nucleación del solo-sitio de Au25 nanoclusters. El mismo enfoque se puede emplear para estudiar cómo otras proteínas17,18,19 complexed con Au(III) puede cambiar sus propiedades intrínsecas de la fluorescentes.
La síntesis del compuesto fluorescente rojo Au BSA requiere un control estrecho de las relaciones molares de BSA para Au (BSA:Au) para maximizar la intensidad de la fluorescencia y la ubicación de los picos en la emisión excitación mapa (EEM)20. Puede ser demostrado que existen múltiples sitios de Unión para que Au(III) a atascarse, incluyendo el fragmento de asparagina (o fragmento de Asp, los primeros cuatro residuos del aminoácido en el N-terminal del BSA)21,22. El aminoácidoth 34 de BSA (Cys-34) también se indica para coordinar Au(III) y participar en el mecanismo de la fluorescence([Cys34-capped-BSA]-Au(III)) rojo20. Al unirse todos enlaces de disulfuro de la Cys-Cys y tapado todo fluorescencia de tioles, rojo no es producido ([all-thiol-capped-BSA]-Au(III)). Esto indica la necesidad de disulfuro de la Cys-Cys como el sitio de Unión Au(III) para producir la fluorescencia roja.
Técnicas de química de proteínas no han sido ampliamente utilizadas para el estudio de los complejos BSA-Au(III) en la comunidad de nano-ciencia. Sin embargo, sería útil emplear estas técnicas para comprender ciertos aspectos de estos complejos, así como para obtener una comprensión detallada de los sitios de unión de Au(III) en BSA. Este artículo pretende mostrar algunas de estas técnicas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los compuestos de BSA-Au(III) preparados a pH 12 exhiben fluorescencia roja en una longitud de onda de emisión de λem= 640 nm cuando se excitó con ultravioleta (UV) luz λex= 365 nm (figura 1A). La aparición de fluorescencia roja es un proceso lento y llevará unos días a temperatura ambiente para aumentar a una intensidad máxima. Funcionando la reacción a 37 ° C dará los resultados óptimos, aunque una temperatura más alta puede utilizarse para produ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
S.E. reconoce el apoyo del fondo de iniciativa especial Duke Endowment, Wells Fargo fondo, PhRMA Foundation, así como fondos de puesta en marcha de la Universidad de Carolina del norte, Charlotte.
Materials
| Bovine Serum Albumin (BSA), 96% | Sigma-Aldrich | A5611 | |
| gold (III) chloride trihydrate, 99.9% | Sigma-Aldrich | 520918 | |
| Copper (II) chloride dihydrate, 99.999% | Sigma-Aldrich | 459097 | |
| Nickel (II) chloride hexahydrate, 99.9% | Sigma-Aldrich | 654507 | |
| N-Ethylmaleimide (NEM), >99.0% | Sigma-Aldrich | 4259 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP), >98.0% | Sigma-Aldrich | C4706 | |
| Sodium hydroxide, >98.0% | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Urea, 99.5% | Chem-Implex Int'l | 30142 | |
| Phospate buffered saline (PBS) | Corning | MT21040CV | |
| Ammonium bicarbonate, 99.5% | Sigma-Aldrich | 9830 |
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