Vurdering af Synaptic grænsefladen af primære menneskelige T celler fra perifert blod og lymfoide væv
Summary
Protokollen beskriver en teknik til at studere primære polyklonale humane T celler evne til at danne synaptic grænseflader ved hjælp af planar lipid dobbeltlag. Vi bruger denne teknik til at vise den differentiale synapse dannelse evne til menneskelige primære T celler, der stammer fra lymfeknuder og perifert blod.
Abstract
Den nuværende forståelse af dynamikken og strukturelle funktioner af T-celle synaptic grænseflader har været stort set beslutsomme ved hjælp af glas-støttede planar dobbeltlag og i in vitro-afledte T-celler kloner eller linjer1,2 ,3,4. Hvordan disse konklusioner gælder for de primære humane T celler isoleret fra blod eller lymfoide væv er ikke kendt, dels på grund af betydelige vanskeligheder med at opnå et tilstrækkeligt antal celler for analyse5. Her løse vi dette gennem udvikling af en teknik, udnytte multikanals flow dias for at opbygge planar lipid dobbeltlag indeholdende aktivering og vedhæftning molekyler. Den lave højde flow dias fremmer hurtig celle sedimentering for at synkronisere celle: tolagede udlæg, hvorved forskere til at studere dynamikken i synaptic interface dannelse og kinetik af granulat frigivelse. Vi anvender denne metode til at analysere synaptiske grænsefladen af så få som 104 til 105 primære befrugtede T celler isoleret fra perifert blod (PB) og lymfeknuder (LN). Resultaterne viser, at romanen planar lipid tolagede teknik gør det muligt for studiet af de biofysiske egenskaber af primære menneskelige T cellerne stammer fra blod og væv i forbindelse med sundhed og sygdom.
Introduction
Videnskabelig viden om de strukturelle egenskaber af T-celle immun synapser og tilknytning til den funktionelle aktivitet af T-celler er blevet genereret primært fra studiet af cellelinjer og kloner stammer fra PB. I hvilken grad disse konklusioner vedrører primære T celler fremstillet af blod eller lymfoide væv er fortsat uklart, da de synaptiske grænseflader af T-celler bosat i lymfoide og andre væv ikke er blevet analyseret hidtil. Vigtigere, tyder nye oplysninger på, at væv er hjemmehørende og lymfoide-orgel-afledte T celler kan have betydelige forskelle i deres fænotype og funktionel aktivitet sammenlignet med dem i PB6,7. Dette er yderligere størknet behovet for bedre at forstå funktionerne af T-celle synaptic grænseflade i primære humane T celler.
Til dette formål har vi udviklet en roman mini skala tilgang udnytter lipid dobbeltlag indbygget i multikanals flow dias gør det muligt for os at udføre billeddannelse af T-celle/tolagede grænseflader med mindre end 105 primære T celler isoleret fra menneskelige PB og LN. Denne nye teknik giver mulighed for undersøgelse af primære human T-celle synaptic grænseflader for at bedre model og forstå i vivo celle-celle interaktioner biofysiske egenskaber.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den nye teknik beskrevet her udnytter lignende reagenser skal bygge planar dobbeltlag i konventionel flow celle5 og med held kan anvendes til at udføre billeddannelse af primære human T-celle – tolagede grænseflader3,4 ,15. Teknikken tilbyder en betydelig reduktion i den fluorescerende molekyler skik og kræver 10 – 20 x færre T celler i forhold til et flow celle system5, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af R01AI118694 NIH tilskud til Michael R. Betts, som omfatter sub award 566950 til Yuri Sykulev. Vi takker de Sidney Kimmel kræft Center Bioimaging delt ressource for deres fremragende støtte.
Materials
| CD4 T cell isolation kit, human | Miltenyl Biotec | 130-096-533 | |
| CD8 T cells Isolation Kit, human | Miltenyl Biotec | 130-096-495 | |
| DOPC | Avanti Polar Lipids | 850375C | |
| DOGS NTA | Avanti Polar Lipids | 790528C | |
| Biotinyl Cap PE | Avanti Polar Lipids | 870273C | |
| Human Serum Albumin | Octapharma USA | NDC 68982-643-01 | |
| sticky-Slide VI 0.4 | ibidi | 80608 | |
| Coverslips for sticky-Slides | ibidi | 10812 | |
| Bioptech FCS2 Chamber | Bioptech | 060319-2-03 | |
| anti-CD3 antibody | Thermo Fisher Scientific | 16-0037-81 | OKT3 clone, hybridoma cells are available from ATCC |
| anti- CD28 antibody | Genetex | GTX14664 | 9.3 clone |
| Casein | Sigma | C5890 | |
| Biotin-PEO4-NHS | Thermo Fisher Scientific | 21329 | |
| DMSO | Sigma | D2650-5 | |
| Alexa Fluor 488 protein labeling kit with column for labeled protein purification | Thermo Fisher Scientific | A10235 | |
| Alexa Fluor 568 protein labeling kit with column for labeled protein purification | Thermo Fisher Scientific | A10238 | |
| Amersham Cy5 NHS Ester | GE Life Science | PA15101 | |
| pMT/V5-His A, B, C Drosophila Expression Vectors | Thermo Fisher Scientific | V412020 | |
| pcopneo, G418 Drosophila expression vector for positive selection | ATCC | 37409 | |
| Serum free Drosophial media Insect-XPRESS | Lonza | 12-730Q | |
| Hybridoma YN1/1.7.4 | ATCC | CRL1878 | The hybridoma secrets antibody against ICAM-1. |
| Cyanogen bromide-activated-Sepharose 4B | Sigma-Aldrich | C9142 | Utilized for preparation of Sepharose with covelently bound anti-ICAM antibody. |
| MasterFlex tangential flow concentrator | Cole-Parmer | 77601-60 7592-40 | Used for ICAM-1 containing supernatant concentration and dialysis of ICAM-1 containing supernant |
| Centramate Lab Tangential Flow Systems | Pall Laboratory | FS002K10 OS010T12 FS005K10 | Used for ICAM-1 containing supernatant concentration and dialysis of ICAM-1 containing supernant |
| Ni-NTA Agarose | QIAGEN | 30210 | |
| Dialysis tubing | Spectra/Por | 131384 | |
| Papain from papaya latex | Sigma | P3125 | |
| mouse anti-human antibody against CD107a | BD Bioscences | 555798 | Clone H4A3 |
| Ansell Natural Blue Gloves | Fisher Scientific | 19-014-539 | |
| Nalgene Polypropylene Scissor-Type Forceps | Thermo Fisher Scientific | 6320-0010 | |
| Streptavidin | ProZyme | SA10 | |
| Confocal microscope | Nikon | Nikon TiE inverted microscope equipped with PFS for long-term image stability control, 60x oil objectives, 4 lasers with excitation lines at 405, 458, 488, 514, 561, and 640 nm, 2 GaAsP detectors and 2 high sensitivity PMTs, DIC transmitted light, Programmable X,Y,Z stage for multiple positions and stitching of large areas, time lapse functions, Tokai-Hit temperature and CO2-controlled chamber for live imaging, and anti-vibration isolation table | |
| TIRF microscope | Andor | Andor Revolution XD system equipped with Nikon TIRF-E illuminator, Lasers with 405,488,561 and 640 lines, DIC transmitted light, Yokogawa CSU-X1 spinning disk head for confocal imaging, 100/1.49 NA objective, Andor iXon X3 EM-CCD camera, objective heater, and a piezoelectric motorized stage with Perfect Focus System (PFS) | |
| MetaMorph Premier Image Analysis Software | Molecular devices |
References
- Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285, 221-227 (1999).
- Somersalo, K., et al. Cytotoxic T lymphocytes form an antigen-independent ring junction. Journal of Clinical Investigation. 113, 49-57 (2004).
- Beal, A. M., et al. Protein kinase C theta regulates stability of the peripheral adhesion ring junction and contributes to the sensitivity of target cell lysis by CTL. The Journal of Immunology. 181, 4815-4824 (2008).
- Beal, A. M., et al. Kinetics of early T cell receptor signaling regulate the pathway of lytic granule delivery to the secretory domain. Immunity. 31, 632-642 (2009).
- Dustin, M. L., Starr, T., Varma, R., Thomas, V. K. Supported planar bilayers for study of the immunological synapse. Current Protocols in Immunology. , (2007).
- Reuter, M. A., et al. HIV-Specific CD8(+) T Cells Exhibit Reduced and Differentially Regulated Cytolytic Activity in Lymphoid Tissue. Cell Reports. 21, 3458-3470 (2017).
- Buggert, M., et al. Limited immune surveillance in lymphoid tissue by cytolytic CD4+ T cells during health and HIV disease. PLoS Pathogens. 14, e1006973 (2018).
- Carrasco, Y. R., Fleire, S. J., Cameron, T., Dustin, M. L., Batista, F. D. LFA-1/ICAM-1 interaction lowers the threshold of B cell activation by facilitating B cell adhesion and synapse formation. Immunity. 20, 589-599 (2004).
- Anikeeva, N., et al. Distinct role of lymphocyte function-associated antigen-1 in mediating effective cytolytic activity by cytotoxic T lymphocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 6437-6442 (2005).
- Steblyanko, M., Anikeeva, N., Campbell, K. S., Keen, J. H., Sykulev, Y. Integrins Influence the Size and Dynamics of Signaling Microclusters in a Pyk2-dependent Manner. The Journal of Biological Chemistry. 290, 11833-11842 (2015).
- Anikeeva, N., Lebedeva, T., Sumaroka, M., Kalams, S. A., Sykulev, Y. Soluble HIV-specific T-cell receptor: expression, purification and analysis of the specificity. Journal of Immunological Methods. 277, 75-86 (2003).
- Monks, C., Freiberg, B., Kupfer, H., Sciaky, N., Kupfer, A. Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells. Nature. 395, 82-86 (1998).
- Riddell, S. R., Greenberg, P. D. The use of anti-CD3 and anti-CD28 monoclonal antibodies to clone and expand human antigen-specific T cells. Journal of Immunological Methods. 128, 189-201 (1990).
- Lin, S. J., Yu, J. C., Cheng, P. J., Hsiao, S. S., Kuo, M. L. Effect of interleukin-15 on anti-CD3/anti-CD28 induced apoptosis of umbilical cord blood CD4+ T cells. European Journal of Haematology. 71, 425-432 (2003).
- Anikeeva, N., Sykulev, Y. Mechanisms controlling granule-mediated cytolytic activity of cytotoxic T lymphocytes. Immunologic Research. 51, 183-194 (2011).
- Huppa, J. B., et al. TCR-peptide-MHC interactions in situ show accelerated kinetics and increased affinity. Nature. 463, 963-967 (2010).
