Acellulärt och cellulära Lung modell att studera tumör metastasering

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för en ex vivo lung cancer modell som härmar steg av tumör progression och hjälper till att isolera en primär tumör, cirkulerande tumörceller och metastatiska lesioner.

Abstract

Det är svårt att isolera tumörceller vid olika tidpunkter av tumör progression. Vi skapade en ex vivo lung modell som kan visa växelverkan av tumörceller med en naturlig matris och kontinuerligt flöde av näringsämnen, samt en modell som visar samspelet mellan tumörceller med normala cellulära komponenter och en naturlig matris. Acellulärt ex vivo lung modellen skapas genom isolera en råtta hjärt-lung blockera och ta bort alla celler med hjälp av decellularization process. Den rätt huvudsakliga luftrör är bundna av och tumörceller är placerade i luftstrupen av en spruta. Cellerna flytta och befolka den vänstra lungan. Lungan placeras sedan i en bioreaktor där lungartären tar emot en ström av media i en sluten krets. Tumören vuxit på den vänstra lungan är den primära tumören. Tumörcellerna som isoleras i cirkulerande media cirkulerande tumörceller och tumörcellerna i den högra lungan är metastatiska lesioner. Den cellulära ex vivo lung modellen skapas genom att hoppa över decellularization processen. Varje modell kan användas för att besvara olika forskningsfrågor.

Introduction

Cancer metastaser är skyldige bakom de flesta dödsfall och utgör den ultimata utmaningen i arbetet med att bekämpa cancer. Det övergripande målet med denna metod är att utforma ett protokoll för en fyrdimensionell (4 D) cellkultur som har en dimension av flöde, förutom den tredimensionell (3-D) celltillväxten. Det föreställer tre distinkta faser i processen metastaser [dvs, den primära tumören, cirkulerande tumörceller (CTCs) och metastatiska lesioner].

Under de senaste tre decennierna gett forskare runt om i världen en oöverträffad rikedom av information för att förstå mekanismerna bakom metastasutvecklingen i olika cancerformer som förbättrat utsikterna till ett botemedel eller progressionsfri överlevnad. Kliniska hanteringen av vissa typer av cancer, såsom bröstcancer, förbättrats avsevärt¹; vissa cancerformer, såsom lungcancer, har dock fortfarande en dålig överlevnad². In vitro och i vivo djurmodeller har varit avgörande för att generera nya insikter i de mekanismer som ligger till grund för utvecklingen av sjukdomen. Under de senaste åren, cell linje-derived xenograft (CDX) och patientderiverade xenograft (PDX) har varit mer intresse som de bevara många relevanta inslagen i de mänskliga primärtumör³, såsom tillväxt kinetik, histologiska funktioner, beteende egenskaper, och svaret på behandling. Varje modell har dock sina begränsningar att förstå mekanismen av CTC bildandet och metastasering till ett avlägset orgel^4,5,6.

Nyligen har utvecklat vi en cancer 4 D ex vivo lung modell genom att använda begreppet orgel reengineering och perfusion-baserade cellkultur. Det härmar mänskliga lung cancertillväxt genom att bilda perfusable tumör knölar som växer över tid med en liknande mänskliga cancer-utsöndras protein produktion⁷. Den representerar den gene expression signatur som förutspår dålig överlevnad hos cancerpatienter och visar också en terapeutiskt svar av tumörregression vid cisplatin behandling^8,9. Lungan modellen ändrades ytterligare så att det kan bilda metastatiska lesioner. CTCs utvecklas från en primärtumör och intravasate till vaskulatur och extravasate i kontralaterala lungan att bilda metastatiska lesioner¹⁰. Gen uttryck studier tyder på en distinkt uttryck profil av den primära tumören, CTCs, och de metastatiska lesionerna och uppreglering av en delmängd av de gener som krävs för fenotyp¹⁰. Metastaserande processen på grund av förekomsten av biologiska förhållanden ses hos patienter med cancer. Fördelen med denna modell är förekomsten av en naturlig matris och arkitektur och en genomblödning av näringsämnen som leder till bildandet av tumör knölar. Dessutom ger det också en möjlighet att studera effekterna av olika komponenter av tumör närmiljön eller droger på tumör progression över tiden. Denna modell kan användas för att växa en rad cancerceller (lungcancer, bröstcancer, sarkom etc.) i ett laboratorium set-up.

Protocol

Protokollen för djurförsök godkändes av den institutionella djur vård och användning kommittén vid Houston Methodist Research Institute och utförs i enlighet med alla regler, lagar, riktlinjer och principer. 1. råtta Lung skörd Söva en 4 – till 6-vecka-gammal mansperson Sprague-Dawley råtta genom en intraperitoneal (IP) injektion av ketamin (100 mg/kg) och xylazin (10 mg/kg) i dess flank. Säkerställa anestesi genom att kontrollera en avsaknad av rörelse när bakbenen t…

Representative Results

Lungan skördas från råtta underhåller intakt vaskulatur och alveolerna11 (figur 3A och 3B). Vid decellularization bevaras extracellulär matrix komponenter i ett acellulärt lunga, såsom kollagen, Fibronektin och elastin,11 (figur 3 c, 3D, 3Eoch 3F). Decellularization leder till en fullständig borttagning av d…

Discussion

Ex vivo 4 D lungan ger möjlighet att studera tumörtillväxt och metastas i ett laboratorium set-up. En infödd lung matris är ett komplext system som ger stöd till normal vävnad och underhåller cell-cell interaktioner, cell-matrix interaktioner, celldifferentiering och vävnad organisation. Det ger en möjlighet att lägga till någon tumör mikromiljö komponenter för att studera deras effekter på tumörtillväxt och samspelet med andra celler.

Lungan skörden är den kritisk…

Materials

Sprague Dowley rat	Harlan	206M	Male
Chlorhexidine swab	Prevantics, NY, USA	NDC 10819-1080-1
Heparin	Sagent Pharmaceuticals, Schaumburg, IL, USA	NDC 25021-400-10
18-gauge needle	McMaster Carr, USA	75165A249
2-0 silk tie	Ethicon, San Angelo, TX, USA	A305H
Masterflex L/S pump	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA	EW-07554-80
Masterflex L/S pump head	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA	EW-07519-05
Masterflex L/S pump cartridge	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA	EW-07519-70
Tygon Tube	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA	14171211
MasterFlex Pump tube	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA	06598-16
Female luer lock connectors	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA	45508-34	75165A249
Male luer lock connectors	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA	45513-04
black nylon ring	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA	EW-45509-04
Intravenous set	CareFusion	41134E
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)	Fisher Scientific	CAS151-21-3
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100-1L
Antibiotics	Gibco	15240-062
Silicone oxygenator	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA	ABW00011	Saint-GoBain-
Wire mesh	1164610105	Lowes	New York Wire
Female luer Lug Style TEE	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA	45508-56
Male luer integral lock ring to 200series Barb	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA	45518-08
Female luer thread style coupler	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA	45508-22
Clave connector	ICU Medical	11956
Hi-Flo ™4-way Stopcock w/swivel male luer lock	smith Medical	MX9341L
MasterFlex Pump tube	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA	06598-13	for cannula