خالية من المعايرة في المختبر الكمي للبروتين هومو-أوليجوميريزيشن باستخدام الأجهزة التجارية والحرة والمفتوحة المصدر برمجيات التحليل السطوع
Summary
ويصف هذا البروتوكول نهجاً خالية من المعايرة لتحديد كمية البروتين هومو أوليجوميريزاتيون في المختبر استناداً إلى الأسفار تقلب التحليل الطيفي باستخدام ضوء التجارية الفحص المجهري. يتم عرض الإعدادات الصحيحة اقتناء وأساليب التحليل.
Abstract
عدد والسطوع أسلوب التحليل الطيفي (جبهة القوى الاشتراكية) تقلب الأسفار خالية من المعايرة للكشف عن البروتين هومو-أوليجوميريزيشن. يمكن أن تستخدم استخدام مجهر [كنفوكل] تقليدية مزودة بكاشفات رقمية. ويرد بروتوكول لاستخدام التقنية في المختبر عن طريق حالة استخدام حيث يمكن رؤية عدد والسطوع دقة قياس حالة المسمى مفينوس FKBP12F36V أوليجوميريك قبل وبعد إضافة الدواء ديميريزينج AP20187. وتناقش أهمية استخدام المعلمات اقتناء مجهر الصحيحة وطرق تجهيزها وتحليل البيانات الصحيحة. على وجه الخصوص، يتم التشديد على أهمية اختيار التصحيح فوتوبليتشينج. ويمكن استخدام هذا الأسلوب غير مكلفة لدراسة تفاعلات البروتين البروتين في العديد من السياقات البيولوجية.
Introduction
البروتين-بروتين تفاعلات أنا المختبر ن
تقليديا، علم البلورات وتجارب الرنين المغناطيسي النووي جنبا إلى جنب مع الميكروسكوب الإلكتروني cryo (كريويم) هي التكنولوجيات التي اختارت أن تصف بدقة بنية ثلاثية الأبعاد للبروتينات ووظيفتها بالاستدلال التدقيق في تفاصيل هيكلية عالية الدقة الخاصة بهم. ومع ذلك، البروتينات، وليست هياكل ثابتة ويمكن أن تخضع لمجموعة متنوعة من التغييرات conformational والاهتزازات في الزمان والمكان. وهذا السبب في هيكلية المعلومات من بلورية أو بيانات كريوم تحتاج إلى أن تستكمل مع تقنيات أخرى (مثلاً، ديناميات الجزيئية المحاكاة وتقنيات جزيء واحد): ترتبط وظيفة البروتين في كونفورماشونال التغييرات والتفاعلات، وهذه المعلومات غير موجودة في بنية ثابتة. من أجل التحقيق للديناميات داخل الجزيئية، تقنيات استناداً إلى جزيء واحد “فورستر الرنين نقل الطاقة” (سمفريت) هي فعالة جداً1. هذه النهج قادرين على تقييم مختلف الفئات السكانية الفرعية من جزيئات معقدة من وسائل الإعلام. هذا أمر مهم جداً، كما أن هذه التغيرات السريعة وتحدث أثناء الحصول على البيانات (أي، النانوسيكند إلى النطاق الثاني).
نهجين رئيسيين تستخدم عادة لكشف وتحديد هذه التغييرات: البروتينات في الحل والسطح-التثبيت. للكشف عن التفاعلات بين الجزيئية وبصفة خاصة، عملية ثنائي الناجمة عن يغاندس، سمفريت ليست دائماً أفضل وسيلة. والواقع أن الحنق يعتمد ليس فقط على المسافة (إيتش وان زيرو شمال البحر الأبيض المتوسط) ولكن أيضا في اتجاه قطبانيه اثنين (المانحين ويقبلون، χ2) والتداخل بين الانبعاثات المانحين مع يقبلون امتصاص الأطياف2، ولكن ربما كان هذا الشرط الأخير أقل المهم شريطة أن يمكن experimentalist اختيار الزوجين الحنق الصحيح. وضع غير مؤات من سمفريت لسبر ثنائي هومو يأتي من العلامات من البروتين للفائدة: يمكن فقط أن تكون ثنائي سمفريت مغاير، الكشف عن نسبة تصل إلى 50% (أي، هترو-الحنق فقط ستكون قادرة على الكشف عن الجهات المانحة-يقبلون و المانحة يقبلون هومو-dimers لكن لا مانح أو يقبلون يقبلون، الذي هو الآخر 50 ٪ dimers). استخدام fluorescence ارتباط مطيافية (FCS) ومشتقاتها (فككس، إلخ3) للتأكد من البروتين نشر الثوابت وربط ثوابت في المختبر بديل آخر. ليست قادرة على كامل تقدير هومو-ثنائي أما هذه النهج، كما هو الحال في معامل التركز ونشرها، ونصف قطرها ونشر تدابير FCS واحد من الجسيمات نشرها هي سيئة للغاية تعتمد على الوزن الجزيئي؛ على سبيل المثال إلى زيادة الوقت في الوزن الجزيئي وسوف فقط ينطوي على تغيير إضعاف 2.15 في معامل نشر4. في حالة FCS اللونين أو فككس، سيتبين 50 في المائة فقط من هومو dimers لنفس السبب أعلاه. هي أكثر النهج العملي والكمية للكشف عن هومو-ثنائي في المختبر و في فيفو الحنق هومو5 وعدد والسطوع (ن وب)6. وبالنظر إلى أن الحنق هومو يتطلب استرداد الأجهزة المحددة من قيمة تباين (أي البصرية عناصر/محلل لاستعادة الاستقطاب متوازية ومتعامدة)، N & ب يرد هنا كتقنية ملائمة ل الكشف عن البروتين هومو-ثنائي والتجميع. يمكن أن يكون العاملين في المختبر و في فيفو مع مجموعة تجارية على حد سواء.
عدد والسطوع
وقد ن & ب تمت مراجعتها مؤخرا7. أن المراجعة ركزت على تطبيق هذه التقنية في الخلايا الحية. أنها جديرة بالاهتمام لإعادة إنتاج الشكلية الرياضية هنا كهذه المعادلات سوف تطبق على البيانات التي تم جمعها في المختبر. أولاً، من الضروري لتعريف بعض المصطلحات والكميات الرياضية:
- كيان هو مجموعة من الجزيئات التي ترتبط معا.
- اليورو سطوع كيان هو عدد الفوتونات تنبعث من كل وحدة زمنية (في الإطار).
- n هو عدد الكيانات الحالية.
- بيكسل معين على مدى سلسلة الصورة، متوسط كثافة و σ2 هو الفرق في شدته.
ثم، مع عد فوتون كاشفات وافتراض كيانات متحركة وأي خلفية،
حيث N هو عدد الظاهر و ب هو السطوع الظاهر. ينتج عن هذا
دلال et al. 8 أظهرت أنه مع المعدات التناظرية، يحتاج المرء ثلاثة شروط التصحيح: عامل Sوالخلفية الإزاحة0σ ضجيج قراءات 2. ثم، مرة أخرى بافتراض كيانات متحركة،
إعطاء
لاحظ أن المعادلة المذكورة أعلاه لمختلفة التي تعطي في دلال et al. 8 واستعراض لاحق. 7 أغفلت “في دلال” et al. S في المقام كان بسبب خطأ مطبعي واستنسخ هذا الخطأ في المراجعة. المعادلة أعلاه هو الصحيح. إرشادات لقياس S، تمنح σ والإزاحة02 -جنبا إلى جنب مع شرح لمعانيها-دلال et al. 8
اليورو السطوع غير متناسب للدولة أوليجوميريك للكيانات التي نشرها: اليورو سيكون مرتين كما كبيرة ل dimers كما بالنسبة مونومرات، ثلاثة إضعاف كبير لأرتب كما بالنسبة مونومرات، مرتين كما كبيرة هيكساميرس كما لأرتب وهلم جرا. وبهذه الطريقة، قياس اليورو السطوع، واحد يمكن أن التحديد الكمي لأي نوع من مولتيميريزيشن.
إذا كان هناك خليط دول oligomeric العدد الحالي، وسطوع غير قادر على استرداد فرادى الدول oligomeric الحالية. هذا وجود قيود على هذا الأسلوب.
ديتريند برمجية خوارزمية وناندب
وأكد أهمية تصحيح فوتوبليتشينج وقد تم سابقا9. فوتوبليتشينج حتما يحدث أثناء تجارب الخفيفة الميكروسكوب في الوقت الفاصل بين الوضع؛ على حد سواء في الخلايا الحية و في المختبر. وقد وصف العديد من النهج في الأدب لتصحيح للتبييض7. تقنية التصفية أسي مع الاختيار التلقائي للمعلمة ديتريندينج تي هو أفضل الحالية. وتتكامل في ناندب9البرمجيات الحرة والمفتوحة المصدر. البرامج التي تتطلب المستخدم من اختيار يدوياً على معلمة ديتريندينج في الواقع، يمكن أن يؤدي إلى نتائج غير صحيحة لأن هذا الاختيار المعلمة سيكون على الأرجح تعسفية وغير صحيحة. الخوارزمية تلقائياً بفحص البيانات وتحدد المعلمة المناسبة لذلك، دون الحاجة إلى تدخل المستخدم9. حتى مع أفضل خيار لتجانس المعلمة، ديتريندينج حدودها وتعمل جيدا فقط مع النسب المئوية فوتوبليتشينج أقل من 25%، كما هو موضح بالمحاكاة9. من المثير للاهتمام، عند استخدام روتين ديتريندينج التلقائي، دقة أن واحدة يمكن أن تعمل مع قيم الإضاءة المنخفضة (حتى ب < 1.01)، ومن ثم انخفاض كثافة ولا تزال تكون دقيقة بما يكفي تحديد مقدار هومو-ثنائي.
فوتوبليتشينج يسبب أيضا مشكلة أخرى: وجود فلوروفوريس فوتوبليتشيد في مولتيمير معقدة. وهذا يجعل مثلاً تريمير تبدو وكأنها ديمر عند واحدة من الوحدات الثلاث في تريمير غير الفلورية. هور ومولر10 أظهر كيفية تصحيح هذا وجرى التشديد أيضا على هذا التصحيح في استعراض لاحق7. ويتضمن البرنامج ناندب هذا التصحيح9.
FKBP12 F36V نظام
FKBP12F36V هو بروتين الذي لا أوليجوميريزي بطبيعة الحال ولكن من المعروف أن ديميريزي عند إضافة ال11،AP20187 المخدرات (المعروفة اختصاراً BB ديميريزينج يجند)12. وهذا يجعل من حالة اختبار مثالية لعدد والسطوع: مع المسمى FKBP12F36V، مضاعفة oligomeric الدولة ينبغي أن تراعي عند إضافة BB.
Protocol
Representative Results
Discussion
ن & ب أسلوب للكشف عن استخدام الضوء التجارية المسح مجاهر [كنفوكل] مزودة بأجهزة رقمية للكشف عن مولتيميريزيشن. وهذا النهج جذابة للغاية مقارنة بنقطة واحدة FCS وفككس وسمفريت لأنها المجانية المعايرة وحساب سطوع واضح ومباشر وتركيز مستقلة6. بيد أنه من أهمية كبرى، لتصحيح لتقلبات كثافة تب…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من خلال مؤسسة ويلكوم ترست منح 105278/Z/14/2 المعنية ويمول “المركز ويلكوم ترست” “علم الوراثة البشرية” قبل ويلكوم ترست الأساسية جائزة 203852/Z/16/2. العمل في المجموعة شخص معتمد من قبل المملكة المتحدة “لأبحاث السرطان” (C20724/A14414)، ومجلس البحوث الأوروبية ضمن الاتحاد الأوروبي في أفق 2020 البحث والابتكار البرنامج منحة 647278.
Materials
| RosettaTM (DE3) pLysS cells | Novagen | 70956-3 | |
| Ampicillin | Sigma Aldrich | PubChem Substance ID 329824407 | |
| Chloramphenicol | Sigma Aldrich | PubChem Substance ID: 24892250 | |
| LB starter culture | QIAGEN | ||
| LB medium | QIAGEN | https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/head/search/external-link-icon.gif | |
| IPTG | Sigma Aldrich | PubChem Substance ID 329815691 | |
| IMAC buffer | Medicago | 09-1010-10 | |
| EDTA-free protease inhibitors | Sigma Aldrich | 11873580001 | |
| TALON resin | Clonetech | ||
| Nickel sepharose | GE Healthcare | ||
| S200 16/60 column | GE Healthcare | ||
| Glass bottom 8 well observation dish | Ibidi | 80827 |
References
- Voith von Voithenberg, L., Lamb, D. C. Single pair forster resonance energy transfer: A versatile tool to investigate protein conformational dynamics. BioEssays. 40, (2018).
- Padilla-Parra, S., Auduge, N., Coppey-Moisan, M., Tramier, M. Quantitative FRET analysis by fast acquisition time domain FLIM at high spatial resolution in living cells. Biophysical Journal. 95, 2976-2988 (2008).
- Padilla-Parra, S., Auduge, N., Coppey-Moisan, M., Tramier, M. Dual-color fluorescence lifetime correlation spectroscopy to quantify protein-protein interactions in live cell. Microscopy Research and Technique. 74, 788-793 (2011).
- Muller, J. D., Chen, Y., Gratton, E. Fluorescence correlation spectroscopy. Methods in Enzymology. 361, 69-92 (2003).
- Tramier, M., Coppey-Moisan, M. Fluorescence anisotropy imaging microscopy for homo-FRET in living cells. Methods in Cell Biology. 85, 395-414 (2008).
- Digman, M. A., Dalal, R., Horwitz, A. F., Gratton, E. Mapping the number of molecules and brightness in the laser scanning microscope. Biophysical Journal. 94, 2320-2332 (2008).
- Nolan, R., Iliopoulou, M., Alvarez, L., Padilla-Parra, S. Detecting protein aggregation and interaction in live cells: A guide to number and brightness. Methods. , (2017).
- Dalal, R. B., Digman, M. A., Horwitz, A. F., Vetri, V., Gratton, E. Determination of particle number and brightness using a laser scanning confocal microscope operating in the analog mode. Microscopy Research and Technique. 71, 69-81 (2008).
- Nolan, R., et al. nandb-number and brightness in R with a novel automatic detrending algorithm. Bioinformatics. , (2017).
- Hur, K. H., et al. Quantitative Measurement of Brightness from Living Cells in the Presence of Photodepletion. PLoS One. 9, (2014).
- Amara, J. F., et al. A versatile synthetic dimerizer for the regulation of protein-protein interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 10618-10623 (1997).
- Clackson, T., et al. Redesigning an FKBP-ligand interface to generate chemical dimerizers with novel specificity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 10437-10442 (1998).
- Rollins, C. T., et al. A ligand-reversible dimerization system for controlling protein-protein interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 7096-7101 (2000).
- Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis. Molecular Reproduction and Development. 82, 518-529 (2015).
- . R: A Language and Environment for Statistical Computing. R Core. , (2017).
- . RStudio: Integrated Development Environment for R. R Team. , (2016).
- . nandb R package Available from: https://CRAN.R-project.org/package=nandb (2017)
- Jung, G., Wiehler, J., Zumbusch, A. The photophysics of green fluorescent protein: influence of the key amino acids at positions 65, 203, and 222. Biophysical Journal. 88, 1932-1947 (2005).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nature Methods. 2, 905-909 (2005).
- Butkevich, A. N., et al. Hydroxylated fluorescent dyes for live-cell labeling: synthesis, spectra and super-resolution STED. Chemistry: A European Journal. 23, 12114-12119 (2017).
