Koffein-Extraktion, enzymatische Aktivität und Genexpression von Koffein-Synthase aus Anlage Zellsuspensionen
Summary
Dieses Protokoll beschreibt eine effiziente Methode für die Extraktion und Quantifizierung des Koffeins in Zellsuspensionen von C. Arabica L. und einer experimentellen Verfahren für die Bewertung der enzymatischen Aktivität von Koffein-Synthase mit dem Ausdruck Das Gen, das dieses Enzym kodiert.
Abstract
Koffein (1,3,7-Trimethylxanthine) ist ein Purin-Alkaloid in beliebte Getränke wie Kaffee und Tee vorhanden. Diese sekundären Metaboliten gilt als eine chemische Verteidigung, denn es antimikrobielle Wirkung hat und ein natürliches Insektizid als gilt. Koffein kann auch negative Allelopathische Effekte produzieren, die das Wachstum der umliegenden Pflanzen zu verhindern. Darüber hinaus verbrauchen die Menschen auf der ganzen Welt Koffein für seine schmerzlindernde und stimulierende Wirkung. Aufgrund des Interesses in der technologischen Anwendungen von Koffein ist Forschung auf der biosynthetische Bahn dieser Verbindung gewachsen. Diese Studien konzentrierten sich in erster Linie auf das Verständnis der biochemischen und molekularen Mechanismen, die die Biosynthese von Koffein zu regulieren. In-vitro- Gewebekultur ist ein nützliches System für das Studium dieser biosynthetische Bahn geworden. In diesem Artikel wird Schritt für Schritt-Protokoll für die Quantifizierung von Koffein und Messung der Transkription des Gens (CCS1) Codierung Koffein-Synthase (CS) in Zellsuspensionen von C. Arabica L. sowie seine Tätigkeit beschreiben.
Introduction
Koffein ist eine sekundäre Metaboliten, die Biosynthesized von Pflanzen der Gattung Coffea1ist. Dieses Alkaloid gehört zur Familie methylxanthin und gilt als eine Chemiefabrik Verteidigung, weil es gegen die schädlichen Wirkungen von Krankheitserregern und Pflanzenfresser2,3handeln kann. Dieser Metabolit ist darüber hinaus verantwortlich für die stimulierenden Eigenschaften von Kaffee trinken, die häufig konsumierte weltweit4,5. Aufgrund seiner Eigenschaften interessieren mehrere Forschergruppen Studium die biosynthetische Bahn und Katabolismus von Koffein6,7. Derzeit betreuen Pflanzenkulturen in-vitro- Zelle/Gewebe als Alternative für die Bewertung der Koffein-Ansammlung unter verschiedenen biotischen und abiotischen Strategien8,9.
Koffein-Biosynthese beinhaltet die hydrolytische Freisetzung von 7-methylxanthin aus der entsprechenden Ribose Nukleosid, gefolgt von einem bestellten N-Methylations an den Positionen 3 und 1. Eine spezielle S– Adenosyl-Methionin (SAM)-abhängige N-Methyltransferase (NMT) katalysiert die Methylierung bei Position 7, während Theobromin Synthase (TS) und CS engagieren sich in der 3 – und 1-Methylations, bzw. Herstellung von Theobromin und Koffein. Die Studie von Genen Codierung unterschiedliche NMTs ermöglichte Verständnis der Mechanismen, die Koffein Produktion10,11regelt. CS, die N –Methyltransferase-Aktivität besitzt, katalysiert die letzten beiden Schritte die biosynthetische Weg Koffein11. Kaffeebaum Sämlinge hat sich gezeigt, dass Lichtstrahlung CS Aktivität erhöhen kann, führt zu einer Zunahme der Koffein-Biosynthese. Vor kurzem haben wir gezeigt, dass die Aufrechterhaltung der Zellsuspensionen von C. Arabica L. unter Lichteinstrahlung die optimale Voraussetzung ist für die Bewertung der Auswirkungen, die abiotischen Stressfaktoren beeinflussen die biosynthetische Bahn Koffein8zu produzieren. Die Informationen in diesen Studien haben Anwendungen in metabolic Engineering und Systembiologie für die Studie des biosynthetischen Koffein-Signalwegs in solchen in-vitro- Systemen zu maximieren.
Angesichts der Vorteile ein geeignetes Modell für die Untersuchung von Koffein Biosynthese zu erhalten, haben wir die Extraktionsbedingungen für Koffein auf Zellsuspensionen von C. Arabica L. optimiert Es war auch möglich, ein nützliches Protokoll für das Studium der enzymatische Aktivität sowie methodische Schritte zur Bewertung des gen Abschriften der Coffea -Koffein-Synthase 1 (CCS1) Kodierung dieses Enzym zu entwickeln. Hier berichten wir über ein Protokoll zum Extrahieren und Koffein in C. Arabica Zellsuspensionen von Dünnschichtchromatographie und Densitometrie (TLC-Densitometrie) zu quantifizieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir stellen Ihnen hier die optimalen Bedingungen für die Bewertung der Koffein Inhalt, CS Aktivität und Transkript Ebenen in ein in-vitro- Pflanzen Gewebekultur, z. B. Zellsuspensionen von C. Arabica. Frühere Berichten haben bestätigt, dass die Zellen unter Lichteinstrahlung und in Anwesenheit von Theobromin in das Kulturmedium geeignete Parameter für die Erhöhung von Koffein, die es ermöglichen, die Koffein-Trennverfahren bewerten umgekehrt-Phase Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (RP-HP…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Arbeit unseres Labors wurde finanziert durch einen Zuschuss aus dem Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT 219893) an SMTHS. Diese Forschung wurde auch durch ein Stipendium gewährte CONACyT und Sistema Nacional de Investigadores (4422), RJPK (Nr. 37938) unterstützt. Die Autoren danken CIATEJ für die Nutzung der Anlagen während des Schreibens dieses Manuskriptes. Besonderer Dank sind für alle Empfehlungen im Bereich Molekularbiologie und Valentín Mendoza Rodríguez, IFC, UNAM für die Einrichtungen zu Dr. Víctor Manuel González Mendoza verlängert, während der Dreharbeiten zu diesem Artikel.
Materials
| Murashige & Skoog Basal salt mixture | PhytoTechnology Laboratories | M524 | Packge Size: 50 L Reagent (mg/L) Ammonium Nitrate (1650) Boric acid (6.2) Calcium chloride, anhydrous (322.2) Cobalt Chloride•H2O (0.025) Cupric Sulfate•5H2O (0.025) Na2EDTA•2H2O (37.26) Ferrous Sulfate•7H2O (27.8) Magnesium Sulfate, Anhydrous (180.7) Manganese Sulfate•H2O (16.9) Molybdic Acid (Sodium Salt)• 2H2O (0.25) Potassium Iodide (0.83) Potassium Nitrate (1900) Potassium Phosphate, Monobasic (170) Zinc Sulfate•7H2O (8.6) Supplemented with myo-inositol (100) thiamine (10) cysteine (25) sucrose (30000) 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (3) 6-benzylamine purine (1) |
| Caffeine | SIGMA | C0750-5G | STANDARD-5g |
| Theobromine | SIGMA | T4500 | 20 g |
| CAMAG TLC Scanner-4 | CAMAG | 27.62 | |
| WinCATS Planar Chromatography Manager software | CAMAG | 1.4.10 | Software |
| Isoamyl alcohol (24:1) | SIGMA | C-0549 | 500 mL |
| Cyclohexane | JALMEX | C4375-13 | 1 L |
| Acetone | J.T. BAKER | 900643 | 4 L |
| Methanol | J.T. BAKER | 9093-03 | 4 L |
| Chloroform | JALMEX | C-4425-15 | 3.5 L |
| TLC silica gel 60 F254 | Merck | 1.05554.0001 | TLC plate |
| β-mercaptoethanol | M6250 | SIGMA | 100 mL |
| (+)-sodium L- ascorbate | A4034 | SIGMA | 100 g |
| Trizma base | SIGMA | T6066 | 1 Kg |
| Hydrochloric acid 36.5-38% | J.T. Baker | 9535-05 | 2.5 L |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo scientific | 232227 | Kit |
| Methyl [3H]-S-adenosyl methionine | Perkin Elmer | NET155 | Specific activity of 15 Ci/mmol |
| Liquid scintillation vials | SIGMA | Z253081 | |
| Thermostatic bath/circulator | Cole Parmer | 60714 | |
| Micro centrifugue tube | Eppendorf | Tube of 1.5 mL | |
| Cryogenic vials | Heathrow Scientific | HS23202A | 2 mL |
| Centrifuge 5804 | Eppendorf | 5804 000925 | |
| Vortex | Thermolyne | LR 5947 | |
| Porcelain mortar | Fisherbrand | FB961B | |
| Filter paper | Whatman | Z274844 | Porosity medium |
| Picofuge | Stratagene | 400550 | 2000 x g |
| Analytical balance | AND | HR-120 | Model HR-120 |
| Scintillation counter | Beckman Coulter | 6500 | |
| Gel photodocumentation system | Bio-Rad | Chemic XRS | Model Chemic XRS |
| Compact UV lamp | UVP | 95002112 | UVGL-25 |
| Scienceware HDPE Buchner funnel | SIGMA | 2419907 | Type 37600 mixer |
| TRIzol reagent | Thermo scientific | 15596-018 | 200 mL |
| ReverdAid Reverse transcriptase | Thermo scientific | #EP0441 | 10000 U |
| Oligo (dT)18 primer | Thermo scientific | #S0131 | 100 µM |
| DNase I, RNase-free | Thermo scientific | #EN0525 | 1000 U |
| Magnesium chloride | Thermo scientific | EN0525 | 1.25 mL |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Thermo scientific | EN0525 | 1 mL |
| dNTP mix | Thermo scientific | R0191 | R0191 |
| SYBR Green qPCR Master Mix (2X) | Thermo scientific | K0251 | For 200 reactions of 25 µL |
| PikoReal | Thermo scientific | 2.2 | Software |
| Phenol, pH 8.0, equilibrated, Molecular Biology Grade, Ultrapure | USB | J75829 | 100 mL |
| Isopropyl alcohol | Karal | 2040 | 1 L |
| Ethyl alcohol | SIGMA | 64175 | 1 L |
| Diethyl pyrocarbonate | SIGMA | D5758 | 100 mL |
| Lab Rotator | LW Scientific | Mod. LW210 |
References
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