Kvantifisering av Hypopigmentation aktivitet i Vitro
Summary
Vi beskriver tre eksperimentelle metoder for å vurdere hypopigmentation aktiviteten av kjemikalier i vitro: kvantifisering av 1) mobilnettet tyrosinase aktivitet og 2) melanin innhold og 3) måling av melanin av mobilnettet melanin flekker og bilde analyse.
Abstract
Denne studien presenterer laboratorium metoder for kvantifisering av hypopigmentation aktivitet i vitro. Melanin, store pigment i melanocytter, er syntetisert svar på flere mobilnettet og miljømessige faktorer. Melanin beskytter hudceller fra ultrafiolett skade, men har også Biofysiske og biokjemiske funksjoner. Overdreven produksjon eller akkumulering av melanin i melanocytter føre dermatologiske problemer, for eksempel fregner, mørke flekker, melasma og føflekker. Kontroll av melanogenesis med hypopigmentation agenter er derfor viktig for personer med klinisk eller kosmetisk behov. Melanin er primært syntetisert i melanosomes av melanocytter i en kompleks biokjemiske prosess kalt melanogenesis, som er påvirket av ytre og indre faktorer, som hormoner, betennelse, alder og ultrafiolett lys eksponering. Vi beskriver tre metoder for å bestemme hypopigmentation aktiviteten av kjemikalier eller naturlige stoffer i melanocytter: måling av 1) mobilnettet tyrosinase aktivitet og 2) melanin innhold og 3) flekker og kvantifisere mobilnettet melanin med bilde analyse.
I melanogenesis gir tyrosinase hastighetsbegrensning trinnet som konverterer L-Tyrosin til 3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA) og deretter til dopaquinone. Hemming av tyrosinase er derfor en primær hypopigmentation mekanisme. I kulturperler melanocytter, kan tyrosinase aktivitet kvantifiseres ved å legge L-DOPA som et substrat og måle dopaquinone produksjon av spectrophotometry. Melanogenesis kan også måles ved kvantifisere melanin innholdet. Melanin inneholder mobilnettet brøken ekstraheres med NaOH og melanin er kvantifisert spektrofotometrisk. Endelig kan melanin innholdet kvantifiseres av bildeanalyse etter Fontana-Masson farging av melanin. Selv om resultatene av disse in vitro analyser ikke kan alltid gjengis i menneskelig hud, er disse metodene mye brukt i melanogenesis forskning, spesielt som første skritt å identifisere potensielle hypopigmentation aktivitet. Disse metodene kan også brukes til å vurdere melanocyte aktivitet, vekst og differensiering. Konsistente resultater de tre forskjellige metoder sikre gyldigheten av effekten.
Introduction
Melanin spiller en avgjørende rolle i fysiologi, patologi og toksikologi flere organer inkludert hud, øyne og hjernen1. Hovedfunksjoner av melanin er Foto-screening og biokjemiske effekter. Melanin absorberer nær infrarød og synlig lys samt ultrafiolett (UV) stråling, med økt absorpsjon priser på kortere bølgelengder av lys; dermed beskytter melanin vev fra skader forårsaket av synlig lys eller UV stråling2. Melanin er en antioksidant og har en affinitet for metaller og andre giftige kjemikalier; Det kan derfor beskytte vev fra oksidativt og kjemiske stress3. Men forårsaker overdreven produksjon av melanin dermatologiske problemer.
Kvantitet og kvalitet av melanin i huden og iris er de viktigste faktorer som bestemmer fargen av iris og hud. Enkeltpersoner kan ha forskjellige huden fargen preferanser; noen favoriserer garvet hud, mens andre favorisere lysere hud farger. Avhengig av disse konsument-profiler, er hypopigmentation kosmetikk utviklet for å tilfredsstille enkelte markeder for favoriserte huden farger4. Følgelig er studier av hypopigmentation og anti-melanogenic viktige både vitenskapelig og praktisk.
Melanogenesis er den komplekse prosessen med melanin biosyntesen gjennom en rekke enzymatisk og spontan kjemiske reaksjoner i melanocytter. En melanocyte er omgitt av ca 36 keratinocytter melanocyttene er melanin syntese fabrikkene som distribuerer sine produkter til nærliggende keratinocytter. I huden transporteres melanin produsert og lagret i melanosomal rommet av melanocytter til nabokommunene keratinocytter i overhuden via dendrites.
L-Tyrosin fungerer som første underlaget for melanogenesis og enzym-tyrosinase gir to påfølgende reaksjoner som konverterer L-Tyrosin til 3,4-dihydroxyphenylalanine (DOPA) og deretter til dopaquinone. Disse reaksjonene er hastighetsbegrensningen trinnet i melanogenesis5,6. Hypopigmentation aktivitet kan derfor først måles ved å vurdere mobilnettet tyrosinase aktivitet direkte. Gjør melanocyte ekstrakter som inneholder tyrosinase er ruges med DOPA og dopaquinone produsert i prøvene kan måles ved spectrophotometry på 475 nm. Verdiene er normalisert av protein konsentrasjoner av prøver og stoffer med hypopigmentation aktivitet resultere i mindre dopaquinone formasjon sammenlignet med kontrollene.
Dernest kan hypopigmentation aktivitet kvantifiseres ved å måle melanin i kulturperler melanocytter direkte. Etter behandling av celler med test materialet, trekkes melanin under alkaliske forhold og melanin innholdet er kvantifisert ved spectrophotometry på 400 nm. En hypopigmentation agent vil resultere i en lavere melanin innhold enn det kontroller7.
Endelig kan hypopigmentation aktiviteten kvantifiseres Fontana-Masson melanin flekker og påfølgende bildeanalyser. Fontana-Masson flekker, melanin granulater redusere ammoniakk-sølv nitrat til en synlig svart metallic tilstand og svarte områder av celler i mikroskop-bildene representerer mengden av melanin.
En hypopigmentation agent gir vanligvis konsekvent og sammenlignbare resultater med disse tre metoder, som bekrefter at aktiviteten av stoffet er gyldig. Alternativt kan det være nyttig å måle uttrykk for viktige gener og proteiner i melanogenesis svar på test stoff som undersøke hypopigmentation aktivitet. Tyrosinase er tyrosinase-relaterte proteiner (TRP-1) og dopachrome tautomerase (TRP-2) viktige enzymer i melanogenesis8. Den transkripsjon faktor mikroftalmi-assosiert transkripsjon faktoren (MITF) er en mester regulator i melanogenesis og måling av genet/protein uttrykk nivåene eller en promoter aktivitet analysen kan også brukes til å vurdere hypopigmentation aktivitet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi presentert protokoller for evaluering av hypopigmentation aktiviteten til test forbindelser med kulturperler melanocytter. Representant resultatene viste hypopigmentation effekten av arbutin, en tyrosinase inhibitor som hemmet tyrosinase aktivitet og cellular melanin innhold. Disse metodene er mye brukt i anti-melanogenic aktivitet forskning. Bruker disse analyser, vi har også identifisert flere bioaktive forbindelser som har melanogenesis hemmende effekt på B16F10 celler i siste tiåret9<sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av Korea Institute for treningsplanlegging og -analyse for teknologi i mat og jordbruk skogbruk (IPET) gjennom Agri-Bioindustry teknologi utvikling programmet, finansiert av Landbruksdepartementet, Food and Rural Affairs (MAFRA ) (116159-02-2-WT011) og skolen av biovitenskap og bioteknologi for BK21 pluss, Universitetet.
Materials
| 3,4-Dihydroxy-l-phenylalanine | Sigma | D9628 | |
| Ammonium hydroxide solution | Sigma | #320145 | |
| Arbutin | Fluka | #10960 | |
| DMEM | HyClone | SH30243.01 | |
| FBS | HyClone | SH30084.03 | |
| Formalin | Yakuri Pure Chemicals | #16223 | 37% |
| Gold chloride | American MasterTech | AHG0226 | 0.10% |
| HCl | Samchun chemical | H0255 | |
| KCl | Bio basic Canada Inc. | PB0440 | |
| KH2PO4 | Sigma | #60218 | |
| Na2HPO4 | J.T.Baker | #3817-01 | |
| NaCl | Duksan pure chemicals | #81 | |
| NaOH | Sigma | 655104 | |
| Nuclear fast red | Merck | 100121 | Nuclear fast red 0.1% in 5% aluminum sulfate. |
| Penicillin and streptomycin solution | HyClone | SV30010 | |
| Silver nitrate | Duksan Pure Chemicals | #900 | |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | J.T. Baker | #3817-01 | |
| Sodium phosphate monobasic (Na2HPO4) | Sigma | S5011 | |
| Sodium thiosulfate pentahydrate | Duksan Pure Chemicals | #2163 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Bio Basic Canada | TB0196 | |
| Triton X-100 | Union Carbide | T8787 | |
| Tyrosinase from mushroom | Sigma | T3824 | 25 KU |
References
- Bonaventure, J., Domingues, M. J., Larue, L. Cellular and molecular mechanisms controlling the migration of melanocytes and melanoma cells. Pigment Cell & Melanoma Research. 26 (3), 316-325 (2013).
- Brenner, M., Hearing, V. J. The protective role of melanin against UV damage in human skin. Photochemistry and Photobiology. 84 (3), 539-549 (2008).
- Galvan, I., Solano, F. Melanin chemistry and the ecology of stress. Physiological and Biochemical Zoology. 88 (3), 352-355 (2015).
- Burger, P., Landreau, A., Azoulay, S., Michel, T., Fernandez, X. Skin whitening cosmetics: Feedback and challenges in the development of natural skin lighteners. Cosmetics. 3 (4), 36 (2016).
- Cooksey, C. J., et al. Evidence of the indirect formation of the catecholic intermediate substrate responsible for the autoactivation kinetics of tyrosinase. Journal of Biological Chemistry. 272 (42), 26226-26235 (1997).
- Ando, H., Kondoh, H., Ichihashi, M., Hearing, V. J. Approaches to identify inhibitors of melanin biosynthesis via the quality control of tyrosinase. Journal of Investigative Dermatology. 127 (4), 751-761 (2007).
- Gillbro, J. M., Olsson, M. J. The melanogenesis and mechanisms of skin-lightening agents – existing and new approaches. International Journal of Cosmetic Science. 33 (3), 210-221 (2011).
- Passeron, T., Coelho, S. G., Miyamura, Y., Takahashi, K., Hearing, V. J. Immunohistochemistry and in situ hybridization in the study of human skin melanocytes. Experimental Dermatology. 16 (3), 162-170 (2007).
- Lee, J. H., et al. Momilactione B inhibits protein kinase A signaling and reduces tyrosinase-related proteins 1 and 2 expression in melanocytes. Biotechnology Letters. 34 (5), 805-812 (2012).
- Jun, H. J., et al. Dual inhibitions of lemon balm (Melissa officinalis) ethanolic extract on melanogenesis in B16-F1 murine melanocytes: inhibition of tyrosinase activity and its gene expression. Food Science and Biotechnology. 20 (4), 1051-1059 (2011).
- Jun, H. J., et al. p-Coumaric acid inhibition of CREB phosphorylation reduces cellular melanogenesis. European Food Research and Technology. 235 (6), 1207-1211 (2012).
- Jun, H. J., et al. Dual inhibition of γ-oryzanol on cellular melanogenesis: inhibition of tyrosinase activity and reduction of melanogenic gene expression by a protein kinase a-dependent mechanism. Journal of Natural Products. 75 (10), 1706-1711 (2012).
- Choi, Y. M., et al. Effects of the isoflavone puerarin and its glycosides on melanogenesis in B16 melanocytes. European Food Research and Technology. 231 (1), 75-83 (2010).
- Cho, B. R., Jun, H. J., Thach, T. T., Wu, C., Lee, S. J. Betaine reduces cellular melanin content via suppression of microphthalmia-associated transcription factor in B16-F1 murine melanocytes. Food Science and Biotechnology. 26 (5), 1391-1397 (2017).
- Overwijk, W. W., Restifo, N. P. B16 as a mouse model for human melanoma. Current Protocols in Immunology. , (2001).
- Virador, V. M., Kobayashi, N., Matsunaga, J., Hearing, V. J. A standardized protocol for assessing regulators of pigmentation. Analytical Biochemistry. 270 (2), 207-219 (1999).
- D’Mello, S. A. N., Finlay, G. J., Baguley, B. C., Askarian-Amiri, M. E. Signaling pathways in melanogenesis. International Journal of Molecular Sciences. 17 (7), 1144 (2016).
- Hou, L., Panthier, J. J., Arnheiter, H. Signaling and transcriptional regulation in the neural crest-derived melanocyte lineage: interactions between KIT and MITF. Development. 127 (24), 5379-5389 (2000).
- Hedley, S. J., Gawkrodger, D. J., Weetman, A. P., MacNeil, S. α-MSH and melanogenesis in normal human adult melanocytes. Pigment Cell Research. 11 (1), 45-56 (1998).
- Hu, D. N. Methodology for evaluation of melanin content and production of pigment cells in vitro. Photochemistry and Photobiology. 84 (3), 645-649 (2008).
- Carriel, V. S., et al. A novel histochemical method for a simultaneous staining of melanin and collagen fibers. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 59 (3), 270-277 (2011).
