Количественная оценка деятельности гипопигментация в пробирке
Summary
Мы опишем три экспериментальные методы для оценки деятельности гипопигментация химических веществ в пробирке: количественная оценка деятельности и 2) меланина содержание 1) сотовых тирозиназы и 3) измерение меланина сотовой меланина окрашивание и изображения анализа.
Abstract
Это исследование представляет лабораторных методов для количественной оценки гипопигментация активность в лабораторных условиях. Меланин, основных пигмента в меланоцитов, синтезируется в ответ на несколько клеточных и экологических факторов. Меланин защищает клетки кожи от ультрафиолетового повреждения, но также биофизических и биохимических функций. Чрезмерное производство или накопление меланина в меланоцитов может вызвать дерматологических проблем, таких как веснушки, темные пятна, меланодермия и родинки. Таким образом у людей с клинической или косметических потребностями важен контроль меланогенеза с гипопигментация агентов. Меланин главным образом синтезируется в меланосомы меланоцитов в сложный биохимический процесс, называемый меланогенеза, которая находится под влиянием внешние и внутренние факторы, такие как гормоны, воспаление, возраст и ультрафиолетовых лучей. Мы опишем три метода для определения активности гипопигментация химических веществ или природных веществ в меланоциты: Измерение 1) сотовых тирозиназы активности и содержание меланина 2) и 3) пятная и количественного определения сотовой меланина с изображением анализ.
В меланогенеза тирозиназы катализирует тариф ограничивая шаг, который преобразует L-тирозин в 3,4-Диоксифенилаланин (л-дофа) и затем в допаквинон. Таким образом ингибирования тирозиназы — это основной гипопигментация механизм. В культивированный меланоцитов активность тирозиназы может быть определена количественно, добавляя l-допы как субстрат и измерения допаквинон производства методом спектрофотометрии. Меланогенеза может также измеряться путем количественной оценки содержание меланина. Меланин содержащих сотовой фракция добывается с NaOH и меланина количественно спектрофотометрически. Наконец может быть определена количественно содержание меланина, путем анализа изображений после фонтана-Masson пятнать меланина. Хотя результаты этих анализов в лабораторных условиях не всегда могут быть воспроизведены в коже человека, эти методы широко используются в меланогенеза исследований, особенно в качестве первого шага для выявления потенциальных гипопигментация активности. Эти методы могут также использоваться для оценки активности меланоцитов, роста и дифференцировки. Согласованные результаты с тремя различными методами обеспечения достоверности эффектов.
Introduction
Melanin играет решающую роль в физиологии, патологии и токсикологии ряда органов, включая кожу, глаза и мозг1. Основные функции меланина, Фото скрининг и биохимические эффекты. Меланин поглощает инфракрасный и видимый свет, а также ультрафиолетового (УФ) излучения, с показателями увеличения поглощения при более коротких длинах волн света; Таким образом меланин защищает ткани от повреждения, вызванные видимого света или ультрафиолетового излучения2. Меланин является антиоксидантом и обладает сродством для металлов и других токсичных химических веществ; Таким образом он может защитить тканей от окислительного и химического стресса3. Однако чрезмерное производство меланина вызывает Дерматологические проблемы.
Количество и качество меланина в коже и радужки являются наиболее важными факторами, определяющими цвет радужной оболочки и кожу. Люди могут иметь разные кожи цветовые предпочтения; Некоторые пользу загорелой кожи, в то время как другие выступают светлее цвета кожи. В зависимости от этих профилей потребителя гипопигментация косметики были разработаны для удовлетворения индивидуальных рынков для благоприятствования кожи цвета4. Соответственно исследования гипопигментация и анти melanogenic деятельности являются важными научно и практически.
Меланогенеза — сложный процесс биосинтеза меланина через ряд ферментных и спонтанное химических реакций в меланоциты. Один меланоцит окружена примерно 36 кератиноцитов и меланоцитов являются заводы синтез меланина, которые распространяют их продукт для соседних кератиноцитов. В коже меланин производятся и хранятся в melanosomal отсеке меланоцитов транспортируется в соседних кератиноцитов эпидермиса через дендритов.
L-тирозин служит первоначальный субстрат для меланогенеза и фермента тирозиназы катализирует два последовательных реакций, которые преобразуют L-тирозин в 3,4-Диоксифенилаланин (ДОПЫ), а затем в допаквинон. Эти реакции являются тариф ограничивая шаг в меланогенеза5,6. Соответственно деятельность гипопигментация сначала может измеряться путем оценки активности клеточных тирозиназы непосредственно. Чтобы сделать это, экстракты меланоцитов, содержащие тирозиназы инкубируют с ДОПЫ и допаквинон производится на образцах может измеряться методом спектрофотометрии на 475 Нм. Значения нормализованы по концентрации белка образцов и веществ с гипопигментация результат деятельности в формировании меньше допаквинон, по сравнению с контролем.
Во-вторых гипопигментация активность может быть определена количественно измеряя меланина в культивированный меланоцитов непосредственно. После обработки клеток с испытательным материалом, меланин добывается в щелочных условиях и содержание меланина количественно методом спектрофотометрии на 400 Нм. Агент гипопигментация приведет к более низким содержанием меланина, чем элементы управления7.
Наконец гипопигментация активность может быть квантифицировано фонтана-Masson меланина окрашивание и последующего анализа. В Fontana-Masson окрашивание, гранулы меланина уменьшить аммиака Серебряный нитрат видимое состояние черный металлик и черные области ячеек в микроскопических изображений представляют количество меланина.
Гипопигментация агент обычно дает результаты, последовательной и сопоставимой с помощью этих трех методов, которая подтверждает, что действие вещества является допустимым. Кроме того это может быть полезно для измерения выражение ключевых генов и белков в меланогенеза в ответ на тест вещество для изучения активности гипопигментация. Помимо тирозиназы важнейших ферментов в меланогенеза8являются Тирозиназа связанных белков (ГТО-1) и dopachrome tautomerase (ГТО-2). Транскрипционный фактор фактор транскрипции микрофтальмия связанные (MITF) является основной регулятор меланогенеза и количественная оценка ее уровни выражения гена/белков или промоутера деятельности пробирного также может использоваться для оценки деятельности гипопигментация.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы представили протоколы для оценки гипопигментация активности тестирования соединений с помощью искусственного меланоцитов. Представитель результаты показали гипопигментация эффект арбутин, ингибитор тирозиназы, который препятствует тирозиназы активности и сотовых содержание м?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Кореи институт планирования и оценки технологии в продовольствия, сельского и лесного хозяйства (IPET) через программу развития технологии Agri-биоиндустрии, финансируемая министерством сельского хозяйства, продовольствия и сельских дел (MAFRA ) (116159-02-2-WT011) и школа наук о жизни и биотехнологии для BK21 плюс, Университет Кореи.
Materials
| 3,4-Dihydroxy-l-phenylalanine | Sigma | D9628 | |
| Ammonium hydroxide solution | Sigma | #320145 | |
| Arbutin | Fluka | #10960 | |
| DMEM | HyClone | SH30243.01 | |
| FBS | HyClone | SH30084.03 | |
| Formalin | Yakuri Pure Chemicals | #16223 | 37% |
| Gold chloride | American MasterTech | AHG0226 | 0.10% |
| HCl | Samchun chemical | H0255 | |
| KCl | Bio basic Canada Inc. | PB0440 | |
| KH2PO4 | Sigma | #60218 | |
| Na2HPO4 | J.T.Baker | #3817-01 | |
| NaCl | Duksan pure chemicals | #81 | |
| NaOH | Sigma | 655104 | |
| Nuclear fast red | Merck | 100121 | Nuclear fast red 0.1% in 5% aluminum sulfate. |
| Penicillin and streptomycin solution | HyClone | SV30010 | |
| Silver nitrate | Duksan Pure Chemicals | #900 | |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | J.T. Baker | #3817-01 | |
| Sodium phosphate monobasic (Na2HPO4) | Sigma | S5011 | |
| Sodium thiosulfate pentahydrate | Duksan Pure Chemicals | #2163 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Bio Basic Canada | TB0196 | |
| Triton X-100 | Union Carbide | T8787 | |
| Tyrosinase from mushroom | Sigma | T3824 | 25 KU |
References
- Bonaventure, J., Domingues, M. J., Larue, L. Cellular and molecular mechanisms controlling the migration of melanocytes and melanoma cells. Pigment Cell & Melanoma Research. 26 (3), 316-325 (2013).
- Brenner, M., Hearing, V. J. The protective role of melanin against UV damage in human skin. Photochemistry and Photobiology. 84 (3), 539-549 (2008).
- Galvan, I., Solano, F. Melanin chemistry and the ecology of stress. Physiological and Biochemical Zoology. 88 (3), 352-355 (2015).
- Burger, P., Landreau, A., Azoulay, S., Michel, T., Fernandez, X. Skin whitening cosmetics: Feedback and challenges in the development of natural skin lighteners. Cosmetics. 3 (4), 36 (2016).
- Cooksey, C. J., et al. Evidence of the indirect formation of the catecholic intermediate substrate responsible for the autoactivation kinetics of tyrosinase. Journal of Biological Chemistry. 272 (42), 26226-26235 (1997).
- Ando, H., Kondoh, H., Ichihashi, M., Hearing, V. J. Approaches to identify inhibitors of melanin biosynthesis via the quality control of tyrosinase. Journal of Investigative Dermatology. 127 (4), 751-761 (2007).
- Gillbro, J. M., Olsson, M. J. The melanogenesis and mechanisms of skin-lightening agents – existing and new approaches. International Journal of Cosmetic Science. 33 (3), 210-221 (2011).
- Passeron, T., Coelho, S. G., Miyamura, Y., Takahashi, K., Hearing, V. J. Immunohistochemistry and in situ hybridization in the study of human skin melanocytes. Experimental Dermatology. 16 (3), 162-170 (2007).
- Lee, J. H., et al. Momilactione B inhibits protein kinase A signaling and reduces tyrosinase-related proteins 1 and 2 expression in melanocytes. Biotechnology Letters. 34 (5), 805-812 (2012).
- Jun, H. J., et al. Dual inhibitions of lemon balm (Melissa officinalis) ethanolic extract on melanogenesis in B16-F1 murine melanocytes: inhibition of tyrosinase activity and its gene expression. Food Science and Biotechnology. 20 (4), 1051-1059 (2011).
- Jun, H. J., et al. p-Coumaric acid inhibition of CREB phosphorylation reduces cellular melanogenesis. European Food Research and Technology. 235 (6), 1207-1211 (2012).
- Jun, H. J., et al. Dual inhibition of γ-oryzanol on cellular melanogenesis: inhibition of tyrosinase activity and reduction of melanogenic gene expression by a protein kinase a-dependent mechanism. Journal of Natural Products. 75 (10), 1706-1711 (2012).
- Choi, Y. M., et al. Effects of the isoflavone puerarin and its glycosides on melanogenesis in B16 melanocytes. European Food Research and Technology. 231 (1), 75-83 (2010).
- Cho, B. R., Jun, H. J., Thach, T. T., Wu, C., Lee, S. J. Betaine reduces cellular melanin content via suppression of microphthalmia-associated transcription factor in B16-F1 murine melanocytes. Food Science and Biotechnology. 26 (5), 1391-1397 (2017).
- Overwijk, W. W., Restifo, N. P. B16 as a mouse model for human melanoma. Current Protocols in Immunology. , (2001).
- Virador, V. M., Kobayashi, N., Matsunaga, J., Hearing, V. J. A standardized protocol for assessing regulators of pigmentation. Analytical Biochemistry. 270 (2), 207-219 (1999).
- D’Mello, S. A. N., Finlay, G. J., Baguley, B. C., Askarian-Amiri, M. E. Signaling pathways in melanogenesis. International Journal of Molecular Sciences. 17 (7), 1144 (2016).
- Hou, L., Panthier, J. J., Arnheiter, H. Signaling and transcriptional regulation in the neural crest-derived melanocyte lineage: interactions between KIT and MITF. Development. 127 (24), 5379-5389 (2000).
- Hedley, S. J., Gawkrodger, D. J., Weetman, A. P., MacNeil, S. α-MSH and melanogenesis in normal human adult melanocytes. Pigment Cell Research. 11 (1), 45-56 (1998).
- Hu, D. N. Methodology for evaluation of melanin content and production of pigment cells in vitro. Photochemistry and Photobiology. 84 (3), 645-649 (2008).
- Carriel, V. S., et al. A novel histochemical method for a simultaneous staining of melanin and collagen fibers. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 59 (3), 270-277 (2011).
