Saccharomyces cerevisiae Cinetica di crescita esponenziale nella cultura di Batch per analizzare il metabolismo fermentativo e respiratorio

Summary

Qui presentiamo un protocollo per stimare il metabolismo respiratorio e fermentativo inserendo la crescita esponenziale di Saccharomyces cerevisiae per l’equazione di crescita esponenziale. Calcolo dei parametri cinetici permette per lo screening delle influenze di sostanze/composti sulla fermentazione o respirazione mitocondriale.

Abstract

Cellule di Saccharomyces cerevisiae nella fase esponenziale sostengono la loro crescita con la produzione di ATP attraverso la fermentazione e/o respirazione mitocondriale. La concentrazione di carbonio fermentabili governa principalmente come le cellule di lievito generano ATP; così, la variazione nei livelli di carboidrati fermentescibili guida il metabolismo energetico di S. cerevisiae. Questo documento descrive un metodo di alto-rendimento basato su una crescita esponenziale lievito per stimare gli effetti delle variazioni di concentrazione e la natura della fonte di carbonio sul metabolismo fermentativo e respiratorio. La crescita di S. cerevisiae è misurata in una micropiastra o scossa conica boccetta determinando la densità ottica (OD) a 600 nm. Quindi, una curva di crescita è costruita da tracciato OD rispetto al tempo, che permette l’identificazione e la selezione della fase esponenziale ed è dotato con l’equazione di crescita esponenziale per ottenere parametri cinetici. Bassi tassi di crescita specifici con tempi di raddoppiamento superiori rappresentano generalmente una crescita delle vie respiratorie. Al contrario, tassi di crescita specifici superiori con tempi di raddoppiamento inferiori indicano crescita fermentativo. Valori di soglia di raddoppiare il tempo e il tasso di crescita specifico sono stimati utilizzando il ben note condizioni respiratorie o fermentative, come fonti di carbonio non fermentabili o più alte concentrazioni di zuccheri fermentescibili. Questo è ottenuto per ogni ceppo specifico. Infine, i parametri cinetici calcolati vengono confrontati con i valori di soglia per stabilire se il lievito Mostra una crescita fermentativa e/o respiratoria. Il vantaggio di questo metodo è la sua relativa semplicità per la comprensione degli effetti di un sostanza/composto sul metabolismo fermentativo o respiratorio. È importante sottolineare che la crescita è un processo biologico complesso e intricato; Pertanto, i dati preliminari da questo metodo devono essere corroborati dalla quantificazione del consumo di ossigeno e accumulazione dei sottoprodotti della fermentazione. Quindi, questa tecnica può essere utilizzata come uno screening preliminare di composti/sostanze che possono disturbare o migliorare il metabolismo fermentativo o respiratorio.

Introduction

Crescita di Saccharomyces cerevisiae ha servito come uno strumento prezioso per identificare decine di meccanismi fisiologici e molecolari. La crescita è misurata principalmente in tre modi: diluizioni seriali per spot test, unità formanti colonie contando e curve di crescita. Queste tecniche utilizzabile da solo o in combinazione con una varietà di substrati, condizioni ambientali, mutanti e prodotti chimici per esaminare le risposte specifiche o fenotipi.

La respirazione mitocondriale è un processo biologico in cui cinetica di crescita è stato applicato con successo per scoprire i meccanismi sconosciuti. In questo caso, il completamento della crescita media con carbonio non fermentabili fonti quali glicerolo, lattato o etanolo (che sono metabolizzati esclusivamente tramite respirazione mitocondriale), come l’unica fonte di carbonio e di energia permette di valutare la crescita delle vie respiratorie, che è importante per rilevare perturbazioni nella fosforilazione ossidativa attività¹. D’altra parte, è complicato da usare modelli di cinetica di crescita come un metodo per decifrare i meccanismi dietro la fermentazione.

Lo studio della fermentazione e respirazione mitocondriale è essenziale per delucidare i meccanismi molecolari dietro alcuni fenotipi come il Crabtree e Warburg effetti^2,3. L’effetto Crabtree è caratterizzata da un aumento del flusso glicolitico, repressione di respirazione mitocondriale e l’istituzione di fermentazione come la via primaria per generare ATP in presenza di alte concentrazioni di carboidrati fermentabili (> 0,8 mM)^4,5. L’effetto di Warburg è metabolicamente analogico all’effetto Crabtree, con la differenza è che in cellule di mammifero, il prodotto principale della fermentazione è lattato⁶. Infatti, l’effetto di Warburg è esposto da una varietà di cellule tumorali, innescando l’assorbimento del glucosio e consumo anche in presenza di ossigeno⁷. Quindi, studiare le basi molecolari dell’interruttore dalla respirazione alla fermentazione nell’effetto Crabtree ha ripercussioni biotecnologiche (per la produzione di etanolo) sia potenziali impatti nella ricerca sul cancro.

S. cerevisiae crescita può essere uno strumento adatto per studiare gli effetti di Crabtree e Warburg. Questa idea è basata sul fatto che nella fase esponenziale di lievito, le vie centrali, utilizzate per produrre ATP sono la respirazione mitocondriale e la fermentazione, che sono essenziali per sostenere la crescita. Per esempio, la crescita di S. cerevisiae è intimamente legata alla funzione delle vie di generazione di ATP. Nelle molecole di S. cerevisiae, la respirazione mitocondriale produce circa 18 ATP per molecola di glucosio, mentre la fermentazione genera solo 2 molecole di ATP, quindi ci si aspetta che il tasso di crescita ha stretti legami con le vie metaboliche la produzione di ATP⁸. A questo proposito, quando la fermentazione è la via principale per generare ATP, il lievito compensa la bassa produzione di ATP aumentando il tasso di assorbimento del glucosio. Al contrario, il consumo di glucosio dalle cellule di lievito che utilizzano la respirazione mitocondriale come la principale fonte di ATP è basso. Questo indica che è importante per il lievito a disponibilità di carboidrati senso prima di determinare come verrà generato ATP. Pertanto, la disponibilità di glucosio gioca un ruolo importante nello switch tra fermentazione e respirazione mitocondriale in S. cerevisiae. In presenza di elevate quantità di glucosio, il lievito preferisce fermentazione come la via centrale per generare ATP. È interessante notare che, quando il lievito è fermentazione, il tasso di crescita specifico viene mantenuto al suo massimo. D’altra parte, sotto i bassi livelli di glucosio, S. cerevisiae produce ATP utilizzando la respirazione mitocondriale, mantenere tassi di crescita inferiori. Quindi, variazione della concentrazione di glucosio e l’uso di altre fonti di carbonio indurre cambiamenti nella preferenza di lievito tra crescita fermentativa e respiratoria. Prendendo in considerazione questo fatto con l’equazione di crescita esponenziale, uno può ottenere il significato biologico dei parametri cinetici come raddoppiando il tempo (Dt) e tasso di crescita specifico (µ). Ad esempio, i valori di µ più bassi sono stati trovati quando il lievito utilizza la respirazione mitocondriale come la via primaria. Al contrario, in condizioni che favoriscono la fermentazione, i valori più alti di µ sono stati trovati. Questa metodologia può essere usata per misurare i probabili meccanismi di sostanze chimiche che influenzano la fermentazione e la respirazione mitocondriale in S. cerevisiae.

L’obiettivo di questa carta è di proporre un metodo basato sulla cinetica di crescita per gli effetti di un determinata sostanza/composto sulla respirazione mitocondriale o fermentazione di screening.

Protocol

1. terreni di coltura e preparazione dell’inoculo Preparare 100 mL di terreno liquido 2% lievito estratto-peptone-destrosio (YPD) (aggiungere 1 g di lievito estratto, 2 g di peptone di caseina, e 2 g di glucosio per 100 mL di acqua distillata). Versare 3 mL dei media in provette coniche da 15 mL sterilizzabile. Sterilizzare in autoclave i media per 15 min a 121 ° C e 1,5 psi.Nota: I media possono essere memorizzati fino ad un mese a 4 – 8 ° C. Inoculare un tubo conico riempito con 3 mL di brod…

Representative Results

Curve di crescita possono essere utilizzate per discriminare preliminarmente tra fenotipi respiratori e fermentativi del lievito S. cerevisiae . Di conseguenza, abbiamo effettuato batch colture di S. cerevisiae (BY4742) con le concentrazioni di glucosio differenti che sono state segnalate per indurre la crescita fermentativo: 1%, 2% e 10% (p/v)9. Culture che mostra un fenotipo fermentativo hanno una piccolo lag fase e una fase esponenziale con un …

Discussion

Molto tempo è passato da quando J. Monod¹⁰ espresso che lo studio della crescita delle colture batteriche è il metodo di base di microbiologia. L’avvento degli strumenti molecolari ritarda l’utilizzo e lo studio della crescita come tecnica. Nonostante la complessità della crescita che coinvolge numerosi processi interconnessi, suoi meccanismi di fondo possono essere descritto utilizzando modelli matematici¹¹. Si tratta di un approccio robusto che può essere utilizzato c…

Materials

Orbital Shaker	Thermo Scientific	4353	For inoculum incubation or conical fask cultures
Bioscreen	Growth curves	C MBR	For batch cultures in microplates
Glucose	Sigma	G7021	For YPD broth preparation
Peptone from casein, enzymatic digest	Sigma	82303	For YPD broth preparation
Yeast extract	Sigma	09182-1KG-F	For YPD broth preparation
Bacteriological Agar	Sigma	A5306	For YPD agar preparation
NaH2PO4	Sigma	S8282	For SC broth preparation
(NH4)2SO4	Sigma	A4418	For SC broth preparation
Yeast nitrogen base without amino acids and ammonium sulfate	Sigma	Y1251	For SC broth preparation
Yeast synthetic drop-Out medium supplements	Sigma	Y1501	For SC broth preparation
Ammonium sulfate granular	J.T. Baker	0792-R	For medium supplementation example
Resveratrol	Sigma	R5010	For medium supplementation example
Galactose	Sigma	G8270	For medium supplementation example
Sucrose	Sigma	S7903	For medium supplementation example
Absolut ethanol	Merck	107017	For medium supplementation example
Glycerol	J.T. Baker	2136-01	For medium supplementation example
GraphPad Prism	GraphPad Software		For data analysis
Honeycomb microplates	Thermo Scientific	9502550	For microplate cultures