酵母呼吸と発酵代謝を分析するバッチ文化の指数関数的成長カイネティクス
Summary
ここで指数方程式に酵母の急激な成長をあてはめによる呼吸と発酵の代謝を推定するためのプロトコルを提案する.速度論的パラメーターの計算は、発酵やミトコンドリア呼吸に及ぼす物質・化合物のスクリーニングが可能です。
Abstract
指数段階の酵母細胞が発酵やミトコンドリアの呼吸によって ATP を生産することによって成長を支えます。発酵性の炭素濃度は主に酵母細胞が ATP; を生成する方法を制御します。したがって、発酵性炭水化物含量の変化は、出芽酵母のエネルギー代謝を駆動します。本稿では、濃度の変化の影響と呼吸と発酵の代謝に炭素源の性質を推定する指数の酵母の増殖に基づく高スループット方法について説明します。出芽酵母の成長はマイクロ プレートで測定または円錐動揺 600 の光学濃度 (OD) を決定することによってフラスコ nm。その後、成長曲線は、対指数段階の特定および選定し装備は指数関数的成長方程式運動パラメーターを取得する時間のプロットの OD で組み込まれています。2 倍時間が高い低固有成長率は一般に呼吸成長を表します。逆に、下方の 2 倍の時間で特定の成長率は、発酵の成長を示します。倍加時間と特定の成長率のしきい値は、非発酵性の炭素源や発酵性の糖の高濃度など、よく知られている呼吸または発酵条件を使用して推定されます。これは、各特定の緊張に取得されます。最後に、計算の速度論的パラメーターは、酵母が発酵および/または呼吸の成長を示すかどうかを確立するしきい値と比較されます。この方法の利点は、発酵や呼吸代謝に及ぼす物質/化合物を理解するための相対的なシンプルさです。成長が、複雑な複雑な生物学的プロセスであることを強調することが重要です。したがって、このメソッドからの予備的なデータは、酸素消費量の定量化と発酵副産物の蓄積によって確証する必要があります。これにより、この手法は、邪魔されたり、発酵や呼吸代謝を高める化合物/物質のスクリーニングとして使用できます。
Introduction
酵母の生育生理・分子機構の多数を識別するために貴重なツールとして務めています。成長は主に 3 つの方法によって測定: スポット テスト、コロニー形成単位のカウントは、成長曲線のシリアル希薄。これらの手法は、特定の応答または表現型を調査する単独または様々 な基板、環境条件、変異体、および化学薬品との組み合わせで使用できます。
ミトコンドリアの呼吸は、成長カイネティクスを未知のメカニズムを発見するため正常に適用されている生物学的プロセスです。この場合、非発酵性の炭素の成長媒体の補充源 (ミトコンドリア呼吸により代謝されて排他的) エタノールや乳酸、グリセロールなどの評価により、カーボンおよびエネルギー源として、呼吸器の成長、酸化的リン酸化アクティビティ1の摂動を検出することが重要であります。その一方で、発酵の背後にあるメカニズムを解読するための方法として成長速度論的モデルを使用する複雑です。
クラブツリーとウォーバーグの効果2,3などの特定の表現型の背後にある分子メカニズムを明らかにする発酵とミトコンドリアの呼吸の研究が欠かせません。Crabtree の効果は解糖系フラックスの増加、ミトコンドリア呼吸の抑制、発酵、発酵性炭水化物高濃度の存在下で ATP を生成するための主要な道の確立によって特徴付けられる (>0.8 mM)4,5。Warburg 効果は、発酵の主な製品は、哺乳類細胞、乳酸6されて代謝アナログ違い Crabtree の効果です。確かに、Warburg 効果は、さまざまな癌細胞の糖代謝と酸素7存在下でも消費トリガーによって展示されます。これにより、呼吸から発酵 Crabtree の効果への切り替えの分子基盤を勉強 (エタノール生産) のためのバイオ テクノロジーの影響と潜在的な影響の両方にいるがん研究
出芽酵母成長クラブツリーと Warburg 効果を研究する適切なツールがあります。このアイデアは酵母指数段階の ATP を生成するために使用する中央の経路がミトコンドリアの呼吸と発酵が成長を維持するために不可欠であるという事実に基づいています。例えば、酵母の成長は ATP 生成経路の機能に密接に関連しています。出芽酵母は、ミトコンドリア呼吸生成約 18 ATP 分子グルコース分子あたりの発酵だけ 2 ATP 分子を生成するのに対しそれ故にそれは期待成長率が新陳代謝の細道の緊密なリンクを持っていることATP8を生産します。この点で、発酵が ATP を生成する主要ルートと、酵母は低 ATP 生産のための糖取り込み率を増加を補正します。逆に、ミトコンドリア呼吸を使用して、ATP の主要な源として酵母細胞でブドウ糖の消費は低いです。これは ATP の生成方法を決定する前に感覚の炭水化物の可用性には、酵母にとって重要だを示します。発酵とミトコンドリア呼吸に切り替えるグルコース可用性が重要な役割を果たしているため、酵母。血糖値の高い量の存在下では、酵母は、ATP 生成に中央ルートとして発酵を好みます。興味深いことに、酵母を発酵すると、比増殖速度は最大限に維持されます。その一方で、ブドウ糖の低レベルで出芽酵母は低い成長率を維持するミトコンドリア呼吸を使用して ATP を生成します。それによって、グルコースと他の炭素源の利用の濃度の変化は発酵と呼吸成長間酵母の嗜好の変化を誘発します。指数方程式のこの事実を考慮して、1 つは倍加時間 (Dt) と特定の成長率 (μ) などの速度論的パラメーターの生物学的意義を取得できます。たとえば、酵母の主要な道としてミトコンドリア呼吸を使用する場合、低いμ値が発見されました。逆に、発酵を支持する条件の下で高いμの値が見つかりました。発酵とミトコンドリア呼吸に影響を与えるすべての化学物質の考えられるメカニズムを測定するこの手法を使用することがあります酵母。
本稿の目的は、ミトコンドリアの呼吸または発酵に及ぼす特定物質/化合物をスクリーニングするための成長速度論に基づく方法を提案することです。
Protocol
Representative Results
Discussion
J. モノー10細菌文化の成長の研究、微生物学の基本的な方法を表明した長い時間が経ちました。分子ツールの出現は、使用状況や技術として成長の研究を遅らせます。多数の相互に関連するプロセスを含む成長の複雑さにもかかわらず、内在するメカニズムを数理モデル11を使用して記述できます。これは最も複雑な分子メカニズム12を明?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
このプロジェクトはサポートされているによって付与 y Consejo ナシオナル デ サイエンス テクノロジー (許可番号 293940)、フンダシオン テルメックス TELCEL (許可番号 162005585) の両方の IKOM。
Materials
| Orbital Shaker | Thermo Scientific | 4353 | For inoculum incubation or conical fask cultures |
| Bioscreen | Growth curves | C MBR | For batch cultures in microplates |
| Glucose | Sigma | G7021 | For YPD broth preparation |
| Peptone from casein, enzymatic digest | Sigma | 82303 | For YPD broth preparation |
| Yeast extract | Sigma | 09182-1KG-F | For YPD broth preparation |
| Bacteriological Agar | Sigma | A5306 | For YPD agar preparation |
| NaH2PO4 | Sigma | S8282 | For SC broth preparation |
| (NH4)2SO4 | Sigma | A4418 | For SC broth preparation |
| Yeast nitrogen base without amino acids and ammonium sulfate | Sigma | Y1251 | For SC broth preparation |
| Yeast synthetic drop-Out medium supplements | Sigma | Y1501 | For SC broth preparation |
| Ammonium sulfate granular | J.T. Baker | 0792-R | For medium supplementation example |
| Resveratrol | Sigma | R5010 | For medium supplementation example |
| Galactose | Sigma | G8270 | For medium supplementation example |
| Sucrose | Sigma | S7903 | For medium supplementation example |
| Absolut ethanol | Merck | 107017 | For medium supplementation example |
| Glycerol | J.T. Baker | 2136-01 | For medium supplementation example |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | For data analysis | |
| Honeycomb microplates | Thermo Scientific | 9502550 | For microplate cultures |
References
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