Saccharomyces cerevisiae Exponentiell tillväxt Kinetics i Batch kultur att analysera respiratoriska och fermentativa Metabolism

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för att uppskatta respiratoriska och fermentativa ämnesomsättningen genom att montera den exponentiella tillväxten av Saccharomyces cerevisiae till ekvationen exponentiell tillväxt. Beräkning av de kinetiska parametrarna tillåter för screening av påverkan av ämnen/föreningar på jäsning eller mitokondrie andning.

Abstract

Saccharomyces cerevisiae celler i den exponentiella fasen upprätthålla sin tillväxt genom att producera ATP genom jäsning och/eller mitokondrie respiration. Jäsbara kolhalten reglerar främst hur jästceller generera ATP; Således driver variationen i jäsbara kolhydrater nivåer energisk metabolismen av S. cerevisiae. Detta dokument beskriver en hög genomströmning metod baserad på exponentiell jäst tillväxt att uppskatta effekterna av koncentrationen förändringar och naturen av kol källan på andningsorganen och fermentativa metabolism. Tillväxten av S. cerevisiae är mätt i en mikroplattan eller skakas koniska kolven genom bestämning av den optiska densiteten (OD) på 600 nm. Sedan byggs en tillväxtkurva genom plotting OD kontra tid, vilket gör att identifiering och val av den exponentiella fasen, och är utrustad med exponentiell ekvation att få kinetiska parametrar. Låg specifik tillväxt med högre fördubbling gånger representerar vanligtvis en respiratorisk tillväxt. Däremot indikerar högre specifik tillväxt med lägre fördubbling gånger fermentativa tillväxt. Tröskelvärden för fördubbling tid och tillväxthastighet är beräknat med välkända luftvägs- eller fermentativa villkor, såsom icke-jäsbara kolkällor eller högre koncentrationer av jäsbara sockerarter. Detta erhålls för varje specifik stam. Slutligen, de beräknade kinetiska parametrarna jämförs med tröskelvärdena att fastställa huruvida jästen visar fermentativa eller respiratorisk tillväxt. Fördelen med denna metod är dess relativa enkelhet för att förstå effekterna av en substans/förening på fermentativa eller respiratorisk metabolism. Det är viktigt att betona att tillväxt är en invecklad och komplicerad biologisk process. preliminära data från denna metod måste därför styrkas genom kvantifiering av syreförbrukning och ackumulering av jäsning biprodukter. Därmed, kan denna teknik användas som en preliminär genomgång av föreningar/ämnen som kan störa eller förbättra fermentativa eller respiratorisk metabolism.

Introduction

Saccharomyces cerevisiae tillväxt har fungerat som ett värdefullt verktyg att identifiera dussintals fysiologiska och molekylära mekanismer. Tillväxt mäts primärt av tre metoder: seriespädningar för spot test, kolonibildande enhet räknar och tillväxtkurvor. Dessa tekniker kan användas ensamt eller i kombination med en mängd olika substrat, miljöförhållanden, mutanter och kemikalier för att undersöka specifika reaktioner eller fenotyper.

Mitokondriell andning är en biologisk process där tillväxt kinetik har tillämpats framgångsrikt för att upptäcka okända mekanismer. I detta fall komplettering tillväxt medier med icke-jäsbara kol källor såsom glycerol, laktat eller etanol (som metaboliseras uteslutande av mitokondriell respiration), som den enda källan för kol och energi tillåter för att utvärdera den respiratoriska tillväxt, vilket är viktigt att upptäcka störningar i oxidativ fosforylering aktivitet¹. Däremot, är det komplicerat att använda tillväxt kinetiska modeller som en metod för att dechiffrera mekanismerna bakom jäsning.

Studien av jäsning och mitokondrie respiration är viktigt att klarlägga de molekylära mekanismerna bakom vissa fenotyper av Crabtree och Warburg effekter^2,3. Effekten Crabtree kännetecknas av en ökning av glycolytic flux, förtryck av mitokondriell andning, och inrättandet av jäsning som den primära vägen att generera ATP i närvaro av höga koncentrationer av jäsbara kolhydrater (> 0,8 mM)^4,5. Warburg effekten är metaboliskt analoga Crabtree resonemang, med skillnaden att i däggdjursceller, den viktigaste produkten av jäsning är laktat⁶. Faktiskt, Warburg effekten ställs ut av en mängd olika cancerceller, utlöser glukosupptag och konsumtion även i närvaro av syre⁷. Därmed, har studera den molekylära basen för växeln från andning att jäsning i Crabtree effekt både biotekniska återverkningar (för etanolproduktion) och potentiella effekter i cancerforskning.

S. cerevisiae tillväxt kan vara ett lämpligt verktyg att studera Crabtree och Warburg effekterna. Denna idé är baserad på det faktum att den jäst exponentiella fasen, de centrala vägar som används för att producera ATP är mitokondriell respiration och jäsning, som är nödvändiga för att upprätthålla tillväxten. Till exempel är tillväxten av S. cerevisiae intimt förknippad med funktionen av ATP-genererande vägar. I S. cerevisiae, mitokondriell respiration producerar cirka 18 ATP molekyler per glukos molekyl, medan jäsning genererar endast 2 ATP molekyler, förväntas därav att tillväxttakten har snäva länkar med metaboliska vägar producera ATP⁸. I detta avseende när jäsningen är den främsta vägen att generera ATP, kompenserar jästen låg ATP produktionen genom att öka andelen glukosupptag. Tvärtom, är glukos förbrukning av jästceller som använder mitokondriell andning som ATP huvudkällan låg. Detta indikerar att det är viktigt för jästen att sense kolhydrat tillgänglighet innan man kan avgöra hur ATP kommer att genereras. Därför glukos tillgänglighet spelar en viktig roll i övergången mellan jäsning och mitokondrie respiration i S. cerevisiae. I närvaro av stora mängder glukos föredrar jästen jäsning som den centrala vägen att generera ATP. Intressant, när jästen jäsa, upprätthålls specifika tillväxttakten vid högsta. Däremot, under låga nivåer av glukos producerar S. cerevisiae ATP med hjälp av mitokondriell respiration, upprätthålla lägre tillväxttakt. Därmed, variation i koncentrationen av glukos och användning av andra kolkällor framkalla förändringar i jästens preferens mellan fermentativa och respiratoriska tillväxt. Genom att beakta detta faktum med ekvationen exponentiell tillväxt, kan man få biologiska innebörden av kinetiska parametrar såsom fördubbling tid (Dt) och tillväxthastighet (µ). Till exempel hittades lägre µ värden när jästen använder mitokondriell andning som den primära vägen. Tvärtom, under förhållanden som gynnar jäsningen, hittades högre µ värden. Denna metod kan användas för att mäta de sannolika mekanismerna av kemikalier som påverkar jäsning och mitokondrie respiration i S. cerevisiae.

Syftet med denna uppsats är att föreslå en metod baserad på tillväxt kinetik för screening effekterna av en viss substans/förening på mitokondriell andning eller jäsning.

Protocol

1. kultur Media och inokulum förberedelse Bereda 100 mL 2% jäst extrakt-pepton-dextros (YPD) flytande medium (lägga 1 g jäst extrakt, kaseinpepton, 2 g och 2 g glukos till 100 mL destillerat vatten). Fördela 3 mL av media i 15 mL steriliserbar koniska rör. Autoklav media under 15 minuter vid 121 ° C och 1,5 psi.Obs: Media kan förvaras i upp till en månad vid 4 – 8 ° C. Inokulera ett koniskt rör fyllda med 3 mL cool steril 2% YPD buljong med 250 μL av S. cerevisiae celler bev…

Representative Results

Tillväxtkurvorna kan användas för att preliminärt diskriminera respiratoriska och fermentativa fenotyper i S. cerevisiae jästen. Därför vi utfört batch kulturer av S. cerevisiae (BY4742) med olika glukos koncentrationer som har rapporterats inducera fermentativa tillväxt: 1%, 2% och 10% (w/v)9. Kulturer visar en fermentativa fenotyp har en liten fördröjning och en exponentiell fas med en hög tillväxttakt (figur 1<…

Discussion

Lång tid har gått sedan J. Monod¹⁰ uttryckt att studiet av tillväxten av bakteriekulturer är den grundläggande metoden för mikrobiologi. Tillkomsten av de molekylära verktyg förseningar-användning och studie av tillväxten som en teknik. Trots komplexiteten i tillväxt vilket innebär många inbördes relaterade processer, kan dess underliggande mekanismer beskrivas med hjälp av matematiska modeller¹¹. Detta är en robust metod som kan användas som ett kompletter…

Materials

Orbital Shaker	Thermo Scientific	4353	For inoculum incubation or conical fask cultures
Bioscreen	Growth curves	C MBR	For batch cultures in microplates
Glucose	Sigma	G7021	For YPD broth preparation
Peptone from casein, enzymatic digest	Sigma	82303	For YPD broth preparation
Yeast extract	Sigma	09182-1KG-F	For YPD broth preparation
Bacteriological Agar	Sigma	A5306	For YPD agar preparation
NaH2PO4	Sigma	S8282	For SC broth preparation
(NH4)2SO4	Sigma	A4418	For SC broth preparation
Yeast nitrogen base without amino acids and ammonium sulfate	Sigma	Y1251	For SC broth preparation
Yeast synthetic drop-Out medium supplements	Sigma	Y1501	For SC broth preparation
Ammonium sulfate granular	J.T. Baker	0792-R	For medium supplementation example
Resveratrol	Sigma	R5010	For medium supplementation example
Galactose	Sigma	G8270	For medium supplementation example
Sucrose	Sigma	S7903	For medium supplementation example
Absolut ethanol	Merck	107017	For medium supplementation example
Glycerol	J.T. Baker	2136-01	For medium supplementation example
GraphPad Prism	GraphPad Software		For data analysis
Honeycomb microplates	Thermo Scientific	9502550	For microplate cultures