È descritto un modello di coltura a lungo termine delle cellule della granulosa bovina nelle circostanze senza siero. Questo modello permette ai ricercatori di studiare gli effetti dei diversi fattori e condizioni come densità differente di placcatura sulle caratteristiche della produzione di estrogeno delle cellule della granulosa bovina.
Cellule della granulosa ovarica (GC) sono la fonte principale di sintesi di estradiolo. Indotto dall’ondata preovulatorio dell’ormone luteinizzante (LH), le cellule della teca e, in particolare, dello strato delle cellule della granulosa profondamente cambiano le loro caratteristiche morfologiche, fisiologiche e molecolari e formano il corpus della produzione di progesterone luteo che è responsabile per il mantenimento della gravidanza. Modelli di coltura cellulare sono strumenti essenziali per studiare i meccanismi normativi coinvolti nella trasformazione folliculo-luteale. Il protocollo presentato si concentra sulla procedura di isolamento e criopreservazione di bovino GC da follicoli di piccole e medie dimensioni (< 6 mm). Con questa tecnica, una popolazione quasi pura di GC possa essere ottenuta. La procedura di crioconservazione facilita notevolmente il tempo di lavoro indipendente di una fornitura di tessuto (ovaie) diretta primaria gestione della coltura delle cellule. Questo protocollo descrive un modello di coltura privo di siero cellulare che simula lo stato di estradiolo-attivo di bovino GC. Condizioni importanti che sono essenziali per una cultura di successo steroide-attivo delle cellule sono discussi in tutto il protocollo. È dimostrato che aumentando la densità di placcatura delle cellule induce una risposta specifica, come indicato da una produzione dell'ormone e del profilo di espressione gene alterato. Inoltre, questo modello fornisce una base per ulteriori studi sulla differenziazione di GC e altre applicazioni.
Luteinization e ovulazione successo dipendono finemente sintonizzate e ben orchestrate alterazioni molecolari in tipi differenti delle cellule follicolari somatico. Poiché i dettagli di questi processi di sviluppo ancora completamente non sono capiti, sono necessari maggiori chiarimenti. Approcci in vivo sono elaborati e costosi e, in particolare, non riescono a meccanismi molecolari specifici di indirizzo che si verificano durante la follicologenesi. Di conseguenza, riduttivistico in vitro modelli sono necessari inoltre, per fornire la comprensione nei dettagli molecolari e cellulari. Diversi studi descrivono la cultura dei follicoli tutto nel contesto di in vitro fertilizzazione tecniche1,2,3. Perché i ricercatori sono interessati nei meccanismi di differenziazione, molti studi si concentrano su GC follicolare. Queste cellule, direttamente connesse con l’ovocita, sono le principali fonti di produzione di estrogeni e, pertanto, svolgono un ruolo essenziale in tutto follicologenesi e luteinization4.
Immortalata cella da diverse specie sono state sviluppate linee di GC. La maggior parte di loro, tuttavia, non mostrano un sufficiente ormone steroide produzione5. Finora, solo una varietà di cellula di bovini che GC è stata stabilita6, ma questa linea ha perso la sua attività steroidogenica dopo diversi passaggi7. Pertanto, poiché la steroidogenesi e, in particolare, produzione di estradiolo è una caratteristica essenziale delle funzionalità di GC, si consiglia di studiare questi aspetti in modelli di coltura cellulare primaria. Negli studi precedenti, è stato dimostrato che una produzione considerevole di estradiolo possa essere osservata solamente sotto coltura privo di siero circostanze8,9. Ulteriormente, il completamento di un precursore della sintesi di estradiolo è un altro requisito, come GC non riescono ad esprimere l’enzima necessario che può convertire il progesterone in androstenedione10. Inoltre, l’effetto sinergico di FSH e IGF-1 il completamento in vitro ha rivelato un’attività ottimizzata dell’aromatasi, l’enzima chiave della sintesi di estradiolo11. Nel presente protocollo, altri importanti fattori che hanno un impatto sostanziale sul modello GC cultura inoltre sono descritti. In particolare, la cella densità di placcatura ha enormi effetti sull’esito dell’ esperimento12. Inoltre, una tecnica di crioconservazione di bovino GC che non interferisce significativamente con la fisiologia di GC nella cultura potrebbe essere stabilita. Questa tecnica aiuta a migliorare l’organizzazione del lavoro della coltura delle cellule e per ottimizzare la densità di placcatura preferito.
Il modello della coltura cellulare presentato fornisce uno strumento per analizzare di differenziazione delle cellule della granulosa in vitro. Diversi studi hanno mostrato che una coltura privo di siero è un prerequisito per il mantenimento dell’attività steroide in coltivate bovina GC o GC di altre specie8,9. Inoltre, rivestimento piastra di coltura con componenti della matrice extracellulare (ad es., collagene R)13, migliorato significativamente l’allegato delle cellule. Un’altra caratteristica importante è il periodo di coltura prolungata. Recentemente, è stato dimostrato che una coltura a lungo termine è necessaria ottenere sufficiente attività steroidogenica e un’espressione equilibrata di granulosa cella identità marcatori17. Sembra che il GC richiede il tempo per riprendersi dallo stress fisico durante la procedura di isolamento.
I supplementi di media FSH, IGF-1 e androstenedione sono conosciuti per indurre l’attività di aromatasi in coltivate GC. Soprattutto, il completamento con androstenedione è assolutamente necessario, come il GC bisogno un precursore per la sintesi di estradiolo. Questo è stato pubblicato in precedenza11,18 e, pertanto, non è stato ulteriormente studiato durante lo studio presente. Tuttavia, un adattamento del FSH, IGF-1 e concentrazioni di androstenedione potrebbe essere necessario per altre configurazioni sperimentali.
La tecnica di crioconservazione descritta qui può aiutare a migliorare l’organizzazione di esperimenti di coltura di tessuti rendendoli più indipendente dall’alimentazione varia con le ovaie. Secondo i test precedenti, crioconservazione non influisce il fenotipo GC o la produzione di steroidi nella cultura. Inoltre, l’abbondanza delle trascrizioni di marcatore in cellule coltivate non ha rivelato differenze significative confrontando campioni preparati dalle cellule di recente isolate con quelli precedentemente sottoposti a crioconservazione16.
Un parametro cruciale per l’attuale modello di cultura di GC è la cella densità di placcatura. Come dimostrano i Risultati di rappresentante, aumentando la densità di placcatura ha indotto notevoli cambiamenti delle caratteristiche fisiologiche e molecolari. Diversi geni sono regolati in modo specifico, le modifiche indotte da stimolazione della LH in vivo4,19di somiglianza. Il fatto che un aumento della densità delle cellule può guidare i processi di differenziazione-come in GC bovina coltivate è da considerarsi meticolosamente in questo modello in vitro di GC per evitare risultati conflittuali tra repliche. Di conseguenza, risultati contraddittori con altri studi potrebbero essere attribuiti alle densità differenti delle cellule e dovrebbero essere esaminati più da vicino.
Il modello di cultura descritto qui ha rivelato di essere non-responsivi agli LH, come le trascrizioni del recettore LHCGR sono vicini al limite di rilevazione. Quindi, una simulazione di limpulso del LH sia la situazione in vivo non è riuscito a indurre differenziazione13. Tuttavia, questo modello fornisce uno strumento utile per studiare i GC di estradiolo-attivo nella cultura primaria, in particolare come nessun funzionale bovina GC linee esistono allo stato attuale.
Protocolli di trattamento differenti possono essere testati nell’attuale modello di cultura di GC che aiutano a svelare i meccanismi di regolazione della produzione di steroidi o differenziazione di GC. Ulteriori, singoli fattori che sono coinvolti in processi di sviluppo possono essere analizzati separatamente. Pertanto, questo modello di cultura fornisce una base per molte applicazioni differenti.
The authors have nothing to disclose.
Ringraziamo Veronica Schreiter per la sua ottima assistenza tecnica e utili modifiche del modello di cultura tecnica e cella di crioconservazione stabilito. Inoltre, vorremmo ringraziare Maren Anders e Swanhild Rodewald per la loro eccellente assistenza tecnica nell’analisi successive.
PBS Instamed w/o Ca2+, Mg2+ | Merck-Millipore | L 182-05 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
penicillin / streptomycin (10,000 IU / 10,000 µg/ml) | Merck-Millipore | A 2213 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
amphotericin (250 µg/ml) | Merck-Millipore | A 2612 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
3 ml syringe (Omnifix Luer) | Braun | 4616025V | |
18 G needle | Roth | C724.1 | |
fetal calf serum | Merck-Millipore | S 0115 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
cryo-preservation vials (2 ml) | TPP Faust | TPP 89020 | |
CoolCell LX cell freezing container | Corning | 432004 | |
culture dish, 24-well, flat bottom | TPP Faust | TPP 92424 | |
collagen R (0.2 %) | Serva | 47254 | |
α-MEM | Merck-Millipore | F 0915 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
L-Glutamin (200 mM) | Merck-Millipore | K 0282 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
sodium bicarbonate | Merck-Millipore | L 1713 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
BSA | Sigma | A3311 | |
HEPES | Merck-Millipore | L 1603 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
sodium selenite | Sigma | S9133 | dissolved in sterile water |
transferrin | Sigma | T1283 | dissolved in sterile water |
insulin (10 mg/ml) | Sigma | I0516 | dissolved in 1x PBS |
NEA | Merck-Millipore | K 0293 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
FSH | Sigma | F4021 | we prefer to use a stock solution of 2 µg/ml, diluted in 0.9 % NaCl |
LR3-IGF-1 | Sigma | I1146 | we use a stock solution of 2 µg/ml, dissolved in 10 mM HCl and 1x PBS with 1 mg/ml BSA |
androstenedione | Sigma | 46033 | we use a stock solution of 10 mM, diluted in 100 % ethanol |