Summary

التوليف وتوصيف للمشيمة شوندروتن سلفات (بلكسا)-استهداف المحتوى الدهني-بوليمر جسيمات نانوية

Published: September 18, 2018
doi:

Summary

نقدم هنا، بروتوكولا لتوليف كبريتات شوندروتن المشيمة بربط الببتيد (بلكسا-BP)-مترافق دهن البوليمر جسيمات نانوية عبر خطوة واحدة سونيكاتيون وبيوكونجوجاتي تقنيات. وتشكل هذه الجسيمات أداة جديدة للتنفيذ الهادف للتداوي للأورام البشرية الأكثر والمشيمة تروفوبلاستس لعلاج السرطان والاضطرابات المشيمية.

Abstract

طريقة علاجية فعالة سرطان يقلل ويزيل الأورام مع الحد الأدنى من السمية الشاملة. جسيمات نانوية نشطة تستهدف تقدم نهجاً واعداً لعلاج السرطان. يتم التعبير عن كبريتات شوندروتن المشيمية glycosaminoglycan (بلكسا) على مجموعة واسعة من الخلايا السرطانية و trophoblasts المشيمة، والبروتين الملاريا على وجه التحديد يمكن ربط VAR2CSA بلكسا. يمكنك ربط كبريتات شوندروتن المشيمية عنها بربط ببتيد (بلكسا-BP)، المستمدة من البروتين الملاريا VAR2CSA، أيضا على وجه التحديد بلكسا على الخلايا السرطانية والمشيمة تروفوبلاستس. ومن ثم، يمكن استخدام جسيمات نانوية بلكسا-بي بي-مترافق كأداة لإيصال الأدوية المستهدفة للسرطانات البشرية والمشيمة تروفوبلاستس. في هذا البروتوكول، يصف لنا طريقة لتجميع جسيمات نانوية بوليمر دهن بلكسا-بي بي-مترافق محملة ميتوتريكسات (بلكسا-دنبس)؛ وتتألف الطريقة تقنيات خطوة وبيوكونجوجاتي sonication واحد. وبالإضافة إلى ذلك، يرد وصف أساليب عدة لوصف بلكسا-دنبس، بما في ذلك تحديد الخصائص الفيزيائية الكيميائية والخلوية امتصاص الخلايا المشيمية تشوريوكارسينوما (JEG3)،.

Introduction

طريقة علاجية فعالة سرطان يقلل ويزيل الأورام مع الحد الأدنى من السمية الشاملة. ومن ثم استهداف الورم الانتقائي هو المفتاح لاستكشاف أساليب علاجية ناجحة. جسيمات نانوية فرصة واعدة لعلاج السرطان، وسيعزز فعالية المخدرات التجميعات الجزيئية مع مختلف المجموعات الوظيفية والتقليل من الآثار الجانبية المرتبطة به1،2. وعلاوة على ذلك، تستخدم نظم نانوحبيبات أساسا الاستهداف السلبي والإيجابي للتوصل إلى الهدف الأورام3.

استهداف السلبي يستغل الخصائص الفطرية جسيمات نانوية وزيادة نفاذية والاستبقاء (EPR) تأثيرات للوصول إلى الخلايا السرطانية. الدهنية الموجبة قد استخدمت بنجاح لتسليم المخدرات السرطان المختلفة للأورام في التطبيقات السريرية4،،من56. على الرغم من التأثير العلاجي الفعال السرطان المحتملة، بتركيز منخفض من المخدرات في منطقة الورم وعدم قدرة على التمييز بين الخلايا السرطانية من أنسجة طبيعية هي القيود الرئيسية اثنين من جسيمات نانوية الاستهداف السلبي7.

استراتيجيات الاستهداف النشط الاستفادة ضد مستضد ومستقبلات يجند والتفاعلات الأخرى التعرف الجزيئي لتسليم المخدرات على وجه التحديد إلى أورام8. وأعرب عن كبريتات شوندروتن المشيمية glycosaminoglycan (بلكسا) هو على نطاق واسع في معظم الخلايا السرطانية والمشيمة تروفوبلاستس. وعلاوة على ذلك، البروتين الملاريا VAR2CSA تحديداً ربط بلكسا9،10. ومن ثم فإن VAR2CSA يمكن أن يكون أداة لاستهداف الخلايا السرطانية البشرية. ومع ذلك، عندما يتم مترافق VAR2CSA للجسيمات النانوية، قد تحد من البروتين كامل طول الاختراق من جسيمات نانوية في الخلايا السرطانية. في الآونة الأخيرة، فقد اكتشفنا ببتيد ملزمة بلكسا (بلكسا-BP)، المستمدة من البروتين الملاريا VAR2CSA. جسيمات نانوية بوليمر دهن بلكسا-بي بي-مترافق الرهينة بسرعة إلى خلايا تشوريوكارسينوما وميتوتريكسات زيادة كبيرة (دوكس) نشاط السرطان في فيفو11؛ هذه الجزيئات أيضا على وجه التحديد المستعبدين إلى trophoblasts المشيمة ويمكن أن تستخدم كأداة لإيصال الأدوية المستهدفة ل المشيمة12.

جسيمات نانوية بوليمر الدهن تتكون من قذيفة أحادي الطبقة الدهنية ونواة البوليمرية مسعور وتمثل شركة جديدة لإيصال الأدوية. جسيمات نانوية هذه الجمع بين مزايا الدهنية ونانوكاريرس البوليمرية، مثل حجم نانوحبيبات يمكن السيطرة عليها وعالية توافق مع الحياة، والإفراج عن المخدرات مستمرة، وتحميل المخدرات عالية الكفاءة (LE) والاستقرار الممتاز13. في هذا العمل، استخدمنا أسلوب sonication خطوة واحدة لتجميع جسيمات نانوية بوليمر الدهن. هو سريعة وملائمة ومناسبة للارتقاء بهذا الأسلوب وقد استخدمت على نطاق واسع لإعداد جسيمات نانوية دهن البوليمر لدينا مجموعة11،14 وغيرها15،،من1617،18 .

هيدروكلوريد كاربودييميدي 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) (EDC) كاربودييميدي شعبية المستخدمة كعامل كروسلينكينج للتصريف الجزيئات الحيوية التي تحتوي على كاربوكسيلاتيس والامينات19. بالإضافة إلى تنمية الصادرات، N-هيدروكسيسولفوسوكسينيميدي (NHS) هو الأكثر شيوعاً الكاشف التصريف في المياه السطحية ونانوحبيبات الاقتران ردود فعل20،21. يمكن تقليل عدد ردود فعل الجانب الصحي ويعزز الاستقرار والغلة إستر وسيطة22،23.

هنا، نحن وصف بروتوكول لتوليف جسيمات نانوية بوليمر دهن بلكسا المستهدفة. أولاً، يتم وصف التوليف sonication خطوة واحدة لتحميل دوكس الدهن-بوليمر جسيمات نانوية (DNPs). ثم، يتم عرض أسلوب بيوكونجوجاتي تنمية الصادرات/دائرة الصحة الوطنية لتوليد جسيمات نانوية بوليمر دهن بلكسا-بي بي-مترافق. أيضا يمكن هذا الأسلوب بيوكونجوجاتي متزاوجة الببتيدات إلى جسيمات نانوية والأجسام المضادة الأخرى. وأخيراً، يصف لنا المقايسة خصائص و في المختبر الفيزيائية المستخدمة لتوصيف جسيمات نانوية بوليمر دهن بلكسا المستهدفة. ونحن نعتقد أن هذه الجسيمات النانوية بوليمر دهن بلكسا المستهدفة يمكن أن تشكل نظاما فعالاً للتنفيذ الهادف من المخدرات إلى أمراض السرطان معظم البشرية وتسليم الحمولات المستهدفة للمشيمة لعلاج الاضطرابات المشيمية.

Protocol

1-إعداد حلول الأسهم إعداد محلول مائي من الإيثانول 4% بإذابة 4 مل إيثانول المطلق مع 100 مل الماء عالي النقاوة. مخزن الحل عند 4 درجة مئوية.ملاحظة: يتم تعريف الماء عالي النقاوة كالماء دون الملوثات مثل البكتيريا، والجسيمات، وأيونات، أو نوكليسيس. تم الحصول على الماء عالي النقاوة من نظام لتن?…

Representative Results

في هذا البروتوكول، تعتبر بلجا، دسبي-شماعة-COOH، وفول الصويا الليسيثين البوليمر الممثل، المتقارن الدهن-شماعة-COOH والدهن، على التوالي. ويتضح تركيب جسيمات نانوية بوليمر دهن بلكسا المستهدفة عن طريق خطوة واحدة أسلوب sonication وأسلوب تنمية الصادرات/دائرة الصحة الوطنية في <strong …

Discussion

هذا البروتوكول يوفر طريقة فعالة واستنساخه لتوليف بوليمر دهن بلكسا-بي بي-مترافق جسيمات نانوية. الأسلوب سونيكيشن خطوة واحدة لإعداد جسيمات نانوية دهن البوليمر سريعة واستنساخه وتختلف أساليب نانوبريسيبيتيشن النموذجية التي تشمل التدفئة أو فورتيكسينج أو التبخر. ومن ثم، الأسلوب المتقدمة يقلل …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

أيد منح هذا العمل من البحوث الرئيسية الوطنية وبرنامج التنمية في الصين (2016YFC1000402) والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية (81571445 و 81771617) ومؤسسة العلوم الطبيعية بمقاطعة قوانغدونغ (2016A030313178) إلى X.F. وصندوق البحوث الأساسية شنتشن (JCYJ20170413165233512) إلى X.F.

Materials

plCSA peptide Shanghai GL Biochem 573518 for peptide synthesis
Ethanol absolute Sinopharm Chemical 10009218 for nanoparticles synthesis
Soybean lecithin Avanti Polar Lipids 441601 for nanoparticles synthesis
DSPE-PEG-COOH Avanti Polar Lipids 880125 for nanoparticles synthesis
Doxorubicin JKChemical 113424 for nanoparticles synthesis
Acetonitrile Shanghai Lingfeng 1008621 for nanoparticles synthesis
PLGA Sigma-Aldrich 719897 for nanoparticles synthesis
Ultrasonic processor Sonics VCX130 for nanoparticles synthesis
Centrifuge filter (MWCO 10 kDa) Millipore UFC801024 for nanoparticles purification
centrifuge Sigma 3-18KS for nanoparticles purification
2-[morpholino]ethanesulfonic acid(MES) Sigma-Aldrich M3671 for peptide conjugation
1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) Sigma-Aldrich 3450 for peptide conjugation
N-hydroxysuccinimide (NHS) Sigma-Aldrich 56480 for peptide conjugation
Dialysis bags Spectrum 132592T for nanoparticles purification
PBS Hyclone SH30028.01 for cell culture
10 mL centrifuge tubes, polypropylene Aladdin S-025 for nanoparticles synthesis
15 mL centrifuge tubes, polypropylene Corning 430791 for various applications
0.22 μm sterile syringe filter Millipore SLGV033RB for nanoparticles purification
1 ml syringe, polypropylene BD 328421 for nanoparticles synthesis
Malvern Zetasizer Malvern Nano ZS for particle size analyer
Phosphotungstic acid for TEM
TEM grid EMCN BZ10024a for TEM
UV-VIS spectrometer Leagene DZ0035 for TEM
Transmission
electron microscope
JEOL JEM-100CXII for particle size analyer
BCA reagent A Thermo Fisher Scientific 23228 for BCA assay
BCA reagent B Thermo Fisher Scientific 23224 for BCA assay
96-Well Plates Corning 3599 for BCA assay
Plate reader Thermo Fisher Scientific Multiskan™ GO for BCA assay
12-well plates Corning 3513 for cell culture
JEG3 cell Cell Bank of the Chinese Academy of Sciences TCHu195 Human placenta
DMEM/F12 Hyclone SH30272.01 phenol red-free
Fetal bovine serum (FBS) GIBCO 10100 for cell culture
Penicillin/streptomycin GIBCO 15070063 for cell culture
Fluorescence microscope OLYMPUS CKK53 for celluar uptake
Paraformaldehyde Shanghai Lingfeng 1372021 for celluar uptake
DAPI Sangon Biotech A606584 for celluar uptake
Mounting medium Life P36961 for celluar uptake

References

  1. Davis, M. E., Shin, D. M. Nanoparticle therapeutics: an emerging treatment modality for cancer. Nature Reviews Drug Discovery. 7 (9), 771 (2008).
  2. Nie, S., Xing, Y., Kim, G. J., Simons, J. W. Nanotechnology applications in cancer. Annual Review of Biomedical Engineering. 9, 257-288 (2007).
  3. Jabir, N. R., et al. An overview on the current status of cancer nanomedicines. Current Medical Research and Opinion. 34 (5), 911-921 (2018).
  4. Pillai, G. Nanomedicines for Cancer Therapy: An Update of FDA Approved and Those under Various Stages of Development. SOJ Pharmacy & Pharmaceutical Sciences. 1 (2), 1-13 (2014).
  5. Marta, T., Luca, S., Serena, M., Luisa, F., Fabio, C. What is the role of nanotechnology in diagnosis and treatment of metastatic breast cancer? Promising Scenarios for the Near Future. Journal of Nanomaterials. 2016, e5436458 (2016).
  6. Dasari, S., Tchounwou, P. B. Cisplatin in cancer therapy: molecular mechanisms of action. European journal of Pharmacology. 740, 364-378 (2014).
  7. Brigger, I., Dubernet, C., Couvreur, P. Nanoparticles in cancer therapy and diagnosis. Advanced Drug Delivery Reviews. 64, 24-36 (2012).
  8. Steichen, S. D., Caldorera-Moore, M., Peppas, N. A. A review of current nanoparticle and targeting moieties for the delivery of cancer therapeutics. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 48 (3), 416-427 (2013).
  9. Salanti, A., et al. Targeting human cancer by a glycosaminoglycan binding malaria protein. Cancer Cell. 28 (4), 500-514 (2015).
  10. Seiler, R., et al. An Oncofetal Glycosaminoglycan Modification Provides Therapeutic Access to Cisplatin-resistant Bladder Cancer. European Urology. 72 (1), 142-150 (2017).
  11. Zhang, B., et al. Targeted delivery of doxorubicin by CSA-binding nanoparticles for choriocarcinoma treatment. Drug Delivery. 25 (1), 461-471 (2018).
  12. Zhang, B., et al. Placenta-specific drug delivery by trophoblast-targeted nanoparticles in mice. Theranostics. 26 (2), 130-137 (2018).
  13. Zhang, L., et al. Self-assembled lipid–polymer hybrid nanoparticles: a robust drug delivery platform. ACS Nano. 2 (8), 1696-1702 (2008).
  14. Zheng, M., et al. Single-step assembly of DOX/ICG loaded lipid-polymer nanoparticles for highly effective chemo-photothermal combination therapy. ACS. 7 (3), 2056-2067 (2013).
  15. Fang, R. H., Aryal, S., Hu, C. -. M. J., Zhang, L. Quick synthesis of lipid− polymer hybrid nanoparticles with low polydispersity using a single-step sonication method. Langmuir. 26 (22), 16958-16962 (2010).
  16. Gu, L., et al. Folate-modified, indocyanine green-loaded lipid-polymer hybrid nanoparticles for targeted delivery of cisplatin. Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 28 (7), 690-702 (2017).
  17. Mandal, B., Mittal, N. K., Balabathula, P., Thoma, L. A., Wood, G. C. Development and in vitro evaluation of core-shell type lipid-polymer hybrid nanoparticles for the delivery of erlotinib in non-small cell lung cancer. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 81, 162-171 (2016).
  18. Shi, T., et al. Enhanced legumain-recognition and NIR controlled released of cisplatin-indocyanine nanosphere against gastric carcinoma. European Journal of Pharmacology. 794, 184-192 (2017).
  19. Grabarek, Z., Gergely, J. Zero-length crosslinking procedure with the use of active esters. Analytical Biochemistry. 185 (1), 131-135 (1990).
  20. Hadjipanayis, C. G., et al. EGFRvIII Antibody-Conjugated Iron Oxide Nanoparticles for Magnetic Resonance Imaging-Guided Convection-Enhanced Delivery and Targeted Therapy of Glioblastoma. 암 연구학. 70 (15), 6303-6312 (2010).
  21. Sadhukha, T., Wiedmann, T. S., Panyam, J. Inhalable magnetic nanoparticles for targeted hyperthermia in lung cancer therapy. Biomaterials. 34 (21), 5163-5171 (2013).
  22. Jennings, M., Nicknish, J. Localization of a site of intermolecular cross-linking in human red blood cell band 3 protein. Journal of Biological Chemistry. 260 (9), 5472-5479 (1985).
  23. Staros, J. V. N-hydroxysulfosuccinimide active esters: bis(N-hydroxysulfosuccinimide) esters of two dicarboxylic acids are hydrophilic, membrane-impermeant, protein cross-linkers. 생화학. 21 (17), 3950-3955 (1982).
  24. Valencia, P. M., et al. Single-step assembly of homogenous lipid− polymeric and lipid− quantum dot nanoparticles enabled by microfluidic rapid mixing. ACS. 4 (3), 1671-1679 (2010).
  25. Altintas, I., et al. Nanobody-albumin nanoparticles (NANAPs) for the delivery of a multikinase inhibitor 17864 to EGFR overexpressing tumor cells. Journal of Controlled Release. 165 (2), 110-118 (2013).
  26. Maya, S., et al. Cetuximab conjugated O-carboxymethyl chitosan nanoparticles for targeting EGFR overexpressing cancer cells. Carbohydrate Polymers. 93 (2), 661-669 (2013).
  27. Deepagan, V. G., et al. In vitro targeted imaging and delivery of camptothecin using cetuximab-conjugated multifunctional PLGA-ZnS nanoparticles. Nanomedicine. 7 (4), 507-519 (2012).
  28. Totaro, K. A., et al. Systematic investigation of EDC/sNHS-mediated bioconjugation reactions for carboxylated peptide substrates. Bioconjugate Chemistry. 27 (4), 994-1004 (2016).
  29. Sinz, A. Chemical cross-linking and mass spectrometry to map three-dimensional protein structures and protein-protein interactions. Mass Spectrometry Reviews. 25 (4), 663-682 (2006).
  30. Zhang, B., et al. LDLR-mediated peptide-22-conjugated nanoparticles for dual-targeting therapy of brain glioma. Biomaterials. 34 (36), 9171-9182 (2013).
  31. Koren, E., Apte, A., Sawant, R. R., Grunwald, J., Torchilin, V. P. Cell-penetrating TAT peptide in drug delivery systems: proteolytic stability requirements. Drug Delivery. 18 (5), 377-384 (2011).
  32. Chu, Y., et al. Topical ocular delivery to laser-induced choroidal neovascularization by dual internalizing RGD and TAT peptide-modified nanoparticles. International Journal of Nanomedicine. 12, 1353-1368 (2017).
check_url/kr/58209?article_type=t

Play Video

Cite This Article
Zhang, B., Zheng, M., Cai, L., Fan, X. Synthesis and Characterization of Placental Chondroitin Sulfate A (plCSA)-Targeting Lipid-Polymer Nanoparticles. J. Vis. Exp. (139), e58209, doi:10.3791/58209 (2018).

View Video