Neurogenese mit P19 Embryonalkarzinomzellen
Summary
Die p19 Maus embryonale Karzinom-Zelllinie (P19-Zelllinie) ist weit verbreitet für die Untersuchung des molekularen Mechanismus der Neurogenese mit großer Vereinfachung im Vergleich zur In-vivo-Analyse verwendet. Hier stellen wir ein Protokoll zur Retinosäure-induzierten Neurogenese in der P19-Zelllinie vor.
Abstract
Die P19-Zelllinie, die von einem von Einem Mausembryon abgeleiteten Teratokarzinom abgeleitet wurde, hat die Fähigkeit, sich in die drei Keimschichten zu differenzieren. In Gegenwart von Retinsäure (RA) wird die suspensionskultivierte P19-Zelllinie induziert, um sich in Neuronen zu differenzieren. Dieses Phänomen wird als Neurogenese-Modell in vitro ausgiebig untersucht. Daher ist die P19-Zelllinie sehr nützlich für molekulare und zelluläre Studien im Zusammenhang mit Neurogenese. Protokolle zur neuronalen Differenzierung der in der Literatur beschriebenen P19-Zelllinie sind jedoch sehr komplex. Die in dieser Studie entwickelte Methode ist einfach und wird eine Rolle bei der Aufklärung der molekularen Mechanismen bei neuroentwicklungsbedingten Anomalien und neurodegenerativen Erkrankungen spielen.
Introduction
Während der embryonalen Entwicklung wird eine einzellige Schicht in drei separate Keimschichten1,2,3umgewandelt. Um die Forschungsmöglichkeiten von Phänomenen zu erhöhen, die in vivo vorkommen, wurde die Erzeugung dreidimensionaler Aggregate (embryonale Körper) als praktisches Modell entwickelt. Zellaggregate, die auf diese Weise gebildet werden, können verschiedenen Bedingungen ausgesetzt werden, die eine Zelldifferenzierung verursachen, die die Entwicklung des Embryos4,5widerspiegeln. Die p19 murinische embryonale Karzinom-Zelllinie (P19-Zelllinie) wird häufig als zelluläres Modell für Neurogenese-Studien in vitro6,7,8verwendet. Die P19-Zelllinie weist typische pluripotente Stammzellmerkmale auf und kann sich in Gegenwart von Retinsäure (RA) während der Zellaggregation in Neuronen differenzieren, gefolgt von Neuritenwachstum unter anhaftenden Bedingungen. Darüber hinaus ist die undifferenzierte P19-Zelllinie auch in der Lage, unter dem Einfluss von Dimethylsulfoxid (DMSO)9,10,11,12muskel- und kardiomyozytenähnliche Zellen zu bilden.
Viele Methoden13,14,15,16 wurden für die neuronale Differenzierung berichtet, aber die Methodik ist manchmal kompliziert und nicht leicht zu erfassen, indem man nur die Beschreibungen liest. Beispielsweise erfordern Protokolle manchmal eine Kombination aus Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) Medium, ergänzt durch eine Mischung aus Kalbsserum (CS) und fetalem Rinderserum (FBS)13. Darüber hinaus, Medien für die neuronale Entwicklung verwendet werden oft aus neurobasalen und B27 Ergänzungen13,14,15,16. Daher enthalten bestehende Methoden Komplexität in ihrer Vorbereitung und unser Ziel ist es, die Protokolle zu vereinfachen. In dieser Studie haben wir gezeigt, dass DMEM mit FBS zur Aufrechterhaltung der P19-Zelllinie (DMEM + 10% FBS) sowie zur neuronalen Entwicklung (DMEM + 5% FBS + RA) eingesetzt werden kann. Diese vereinfachte Methode für die Neurogenese mit der P19-Zelllinie ermöglicht es uns, den molekularen Mechanismus zu untersuchen, wie Neuronen entwickelt werden. Darüber hinaus wird die Forschung zu neurodegenerativen Erkrankungen wie der Alzheimer-Krankheit auch mit P19-Zelllinie17,18durchgeführt, und wir glauben, dass die in dieser Studie entwickelte Methode eine Rolle bei der Aufklärung der molekulare Mechanismen bei neuroentwicklungsbedingten Anomalien und neurodegenerativen Erkrankungen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschreiben wir ein einfaches Protokoll für die Neurogenese mit der P19-Zelllinie. Obwohl viele Berichte in dieser Hinsicht veröffentlicht wurden, eine detaillierte Methodik für Neurogenese Induktion mit P19-Zelllinie bleibt unklar. Darüber hinaus haben wir ein einfaches hochglukose (4.500 mg/L) DMEM-Medium mit 10% FBS für das gesamte Experiment verwendet. Dies ermöglichte es uns, das neurogene Experiment benutzerfreundlich durchzuführen und die Anwendung dieser Methode für die Zukunft zu erweitern.
<p c…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Studie wurde vom National Science Centre, Polen (Grant-Nr. UMO-2017/25/N/NZ3/01886) und KNOW (Leading National Research Centre) Scientific Consortium “Healthy Animal – Safe Food”, Entscheidung des Ministeriums für Wissenschaft und Hochschulbildung Nr. 05-1/KNOW2/2015
Materials
| 6x DNA Loading Dye | EURx | E0260-01 | |
| Agarose | Sigma- Aldrich | A9539 | |
| cDNA synthesis kit | EURx | E0801-02 | |
| DAPI (4′,6-Diamidine-2′-phenylindole dihydrochloride) | Sigma- Aldrich | 10236276001 | Working concentration: 1 μg/mL |
| DMEM high glucose (4.5 g/L) with L-glutamine | Lonza | BE12-604Q | |
| Ethanol 99.8% | Chempur | CHEM*613964202 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | EURx | E5050-03 | |
| MAP2 antibody | Thermo Fisher Scientific | PA517646 | Dilution 1:100 |
| PCR reaction kit | EURx | E0411-03 | |
| Penicillin/Streptomycin 10K/10K | Lonza | DE17-602E | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 1x concentrated without Ca2+, Mg2+ | Lonza | BE17- 517Q | |
| Retinoic acid | Sigma- Aldrich | R2625-50MG | dissolved in 99.8% ethanol; store in -20 °C up to 6 months |
| Secondary Antibody (Alexa Fluor 488) | Thermo Fisher Scientific | A11034 | Dilution 1:500 |
| Skim milk | Sigma- Aldrich | 1153630500 | |
| TBE Buffer | Thermo Fisher Scientific | B52 | |
| Triton-X 100 | Sigma- Aldrich | T8787-100ML | |
| Trypsin 0.25% – EDTA in HBSS, without Ca2+, Mg2+,with Phenol Red | biosera | LM-T1720/500 | |
| Cell Culture Plastics | |||
| 1 mL Serological Pipettes | Profilab | 515.01 | |
| 10 mL Serological Pipettes | Profilab | 515.10 | |
| 100 mm dish dedicated for suspension culture | Corning | C351029 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Sigma- Aldrich | CLS430791-500EA | |
| 5 mL Serological Pipettes | Profilab | 515.05 | |
| 6-well plate | Corning | CLS3516 | |
| Cell culture flasks, surface area 25 cm2 | Sigma- Aldrich | CLS430639-200EA |
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