Neurogenesis bruke P19 embryo kreftceller

Summary

Den P19 musen embryonale kreftcelle linje (P19 cellelinje) er mye brukt for å studere den molekylære mekanismen av neurogenesis med stor forenkling i forhold til in vivo analyse. Her presenterer vi en protokoll for retinoic acid-indusert neurogenesis i P19 cellelinjen.

Abstract

Den P19 cellelinje avledet fra en mus embryo-avledet teratocarcinoma har evnen til å differensiere til tre bakterie lag. I nærvær av retinoic syre (RA), suspensjonen kultivert P19 cellelinjen er indusert å differensiere til neurons. Dette fenomenet undersøkes i stor utstrekning som en neurogenesis modell in vitro. Derfor er P19 cellelinjen svært nyttig for molekylær og cellulær studier knyttet til neurogenesis. Men protokoller for neuronal differensiering av P19 cellelinje beskrevet i litteraturen er svært komplekse. Metoden utviklet i denne studien er enkel og vil spille en rolle i Elucidating av molekylære mekanismer i neurodevelopmental unormalt og nevrodegenerative sykdommer.

Introduction

Under embryoutvikling omdannes et enkelt celle lag til tre separate bakterie lag^1,2,3. For å øke forsknings mulighetene for fenomener som forekommer i Vivo, har generering av tredimensjonale aggregater (embryonale organer) blitt utviklet som en praktisk modell. Cellulære aggregater dannet på denne måten kan utsettes for ulike forhold forårsaker celle differensiering, som reflekterer utviklingen av embryo^4,5. P19 murine embryonale kreftcelle linje (P19 cellelinje) brukes vanligvis som en cellulær modell for neurogenesis studier in vitro^6,7,8. Den P19 cellelinjen utstillinger typiske pluripotent stilk cellen funksjoner og kan differensiere til neurons i nærvær av retinoic syre (RA) under celle aggregering etterfulgt av neurite utvekst under tilhenger forhold. Videre er udifferensierte P19 cellelinje også i stand til å forme muskel-og cardiomyocyte-lignende celler under påvirkning av dimethyl sulfoxide (DMSO)^9,10,11,12.

Mange metoder^13,14,15,16 har blitt rapportert for neuronal differensiering, men metodikken er noen ganger komplisert og ikke lett å forstå ved bare å lese beskrivelsene. For eksempel, protokoller noen ganger krever en kombinasjon av Dulbecco ‘ s modifisert Eagle medium (DMEM) medium supplert med en blanding av kalv serum (CS) og fosterets storfe serum (FBS)¹³. Videre medier brukes for neuronal utvikling er ofte sammensatt av Neurobasal og B27 kosttilskudd¹³,^14,15,16. Som sådan, eksisterende metoder inneholder kompleksitet i forberedelsene og vårt mål her er å forenkle protokollene. I denne studien, viste vi at DMEM med FBS kan utnyttes for å opprettholde P19 cellelinjen (DMEM + 10% FBS) samt for neuronal utvikling (DMEM + 5% FBS + RA). Denne forenklede metoden for neurogenesis ved hjelp av P19 cellelinje tillater oss å studere den molekylære mekanismen av hvordan neurons utvikles. Videre er forskning på nevrodegenerative sykdommer som Alzheimers sykdom også gjennomført ved hjelp P19 cellelinje^17,18, og vi tror at metoden utviklet i denne studien vil spille en rolle i Elucidating molekylære mekanismer i neurodevelopmental unormalt og nevrodegenerative sykdommer.

Protocol

1. kultur vedlikehold Kultur P19 cellelinjen i vedlikehold medium (Dulbecco ‘ s modifiserte Eagle ‘ s medium med 4 500 mg/L av glukose supplert med 10% FBS, 100 enheter/mL penicillin og 100 enheter/mL Streptomycin). Ruge ved 37 ° c og 5% CO2. 2. dyrking celler Når cellene nå ca 80% samløpet, fjerne brukt medium fra cellen kulturen kanner (areal 25 cm2). Vask cellene med 2 mL fosfat bufret saltvann (PBS) uten kalsium og magnesium.</l…

Representative Results

Den forenklede ordningen med protokollen for neurogenesis induksjon i P19 cellelinjen er presentert i figur 1. For å definere tegnet av P19 cellelinjen i en udifferensierte tilstand og under neurogenesis, RT-PCR (omvendt transkripsjon-polymerase kjedere reaksjon) metoden ble brukt. Den udifferensierte P19 cellelinje uttrykte pluripotency gener som organisk/carnitine transporter4 (Oct4) og Nanog Homeobox (Nanog). Neurogenesis indusert av cel…

Discussion

Her beskriver vi en enkel protokoll for neurogenesis ved hjelp av P19 cellelinje. Selv om mange rapporter har blitt publisert i denne forbindelse, er en detaljert metodikk for neurogenesis induksjon bruker P19 cellelinje uklart. Videre benyttet vi en enkel høy glukose (4 500 mg/L) DMEM medium med 10% FBS for hele eksperimentet. Dette tillot oss å utføre neurogenic eksperimentet på en brukervennlig måte og utvide bruken av denne metoden for fremtiden.

De mest kritiske punktene i denne prot…

Materials

6x DNA Loading Dye	EURx	E0260-01
Agarose	Sigma- Aldrich	A9539
cDNA synthesis kit	EURx	E0801-02
DAPI (4′,6-Diamidine-2′-phenylindole dihydrochloride)	Sigma- Aldrich	10236276001	Working concentration: 1 μg/mL
DMEM high glucose (4.5 g/L) with L-glutamine	Lonza	BE12-604Q
Ethanol 99.8%	Chempur	CHEM*613964202
Fetal Bovine Serum (FBS)	EURx	E5050-03
MAP2 antibody	Thermo Fisher Scientific	PA517646	Dilution 1:100
PCR reaction kit	EURx	E0411-03
Penicillin/Streptomycin 10K/10K	Lonza	DE17-602E
Phosphate Buffered Saline (PBS), 1x concentrated without Ca2+, Mg2+	Lonza	BE17- 517Q
Retinoic acid	Sigma- Aldrich	R2625-50MG	dissolved in 99.8% ethanol; store in -20 °C up to 6 months
Secondary Antibody (Alexa Fluor 488)	Thermo Fisher Scientific	A11034	Dilution 1:500
Skim milk	Sigma- Aldrich	1153630500
TBE Buffer	Thermo Fisher Scientific	B52
Triton-X 100	Sigma- Aldrich	T8787-100ML
Trypsin 0.25% – EDTA in HBSS, without  Ca2+, Mg2+,with Phenol Red	biosera	LM-T1720/500
Cell Culture Plastics
1 mL Serological Pipettes	Profilab	515.01
10 mL Serological Pipettes	Profilab	515.10
100 mm dish dedicated for suspension culture	Corning	C351029
15 mL centrifuge tubes	Sigma- Aldrich	CLS430791-500EA
5 mL Serological Pipettes	Profilab	515.05
6-well plate	Corning	CLS3516
Cell culture flasks, surface area 25 cm2	Sigma- Aldrich	CLS430639-200EA