Neurogênese usando células de Carcinoma embrionário P19
Summary
A linha celular da carcinoma embrionária do rato P19 (linha celular P19) é amplamente utilizada estudando o mecanismo molecular da neurogênese com grande simplificação comparada à análise in vivo. Aqui, nós apresentamos um protocolo para o neurogênese ácido-induzido retinóico na linha celular P19.
Abstract
A linha celular P19 derivada de um teratocarcinoma embrião-derivado do rato tem a habilidade de diferenciar-se nas três camadas do germe. Na presença de ácido retinóico (RA), a suspensão cultivada linha celular P19 é induzida para diferenciar em neurônios. Este fenômeno é extensivamente investigado como um modelo de neurogênese in vitro. Portanto, a linha celular P19 é muito útil para estudos moleculares e celulares associados à neurogênese. Entretanto, os protocolos para a diferenciação neuronal da linha celular de P19 descritos na literatura são muito complexos. O método desenvolvido neste estudo é simples e vai desempenhar um papel na elucidatação dos mecanismos moleculares em anormalidades NEURODESENVOLVIMENTAIS e doenças neurodegenerativas.
Introduction
Durante o desenvolvimento embrionário, uma única camada de células é transformada em três camadas germinativas separadas1,2,3. Para aumentar as possibilidades de pesquisa de fenômenos ocorridos in vivo, a geração de agregados tridimensionais (corpos embrionários) tem sido desenvolvida como um modelo conveniente. Agregados celulares formados dessa forma podem ser expostos a várias condições que causam diferenciação celular, o que reflete o desenvolvimento do embrião4,5. A linha celular de Carcinoma embrionário P19 murino (linha celular P19) é comumente utilizada como modelo celular para estudos de neurogênese in vitro6,7,8. A linha celular P19 apresenta características de células-tronco pluripotentes típicas e pode diferenciar-se em neurônios na presença de ácido retinóico (RA) durante a agregação celular seguida de crescimento de neurite condições aderentes. Além disso, a linha celular P19 não diferenciada também é capaz de formar células do tipo músculo e cardiomiócitos a influência do dimetil sulfóxido (DMSO)9,10,11,12.
Muitos métodos13,14,15,16 foram relatados para a diferenciação neuronal, mas a metodologia é às vezes complicada e nao fácil de agarrar somente lendo as descrições. Por exemplo, os protocolos às vezes requerem uma combinação do meio modificado de águia de Dulbecco (DMEM) suplementado com uma mistura de soro de bezerro (CS) e soro fetal bovino (FBS)13. Além disso, os meios usados para o desenvolvimento neuronal são compor frequentemente de suplementos de neurobasal e de B2713,14,15,16. Como tal, os métodos existentes contêm complexidade em sua preparação e nosso objetivo aqui é simplificar os protocolos. Neste estudo, Nós demonstramos que DMEM com FBS pode ser utilizado para manter a linha celular P19 (DMEM + 10% FBS) assim como para o desenvolvimento neuronal (DMEM + 5% FBS + RA). Este método simplificado para a neurogênese usando a linha celular P19 nos permite estudar o mecanismo molecular de como os neurônios são desenvolvidos. Além disso, pesquisas sobre doenças neurodegenerativas, como a doença de Alzheimer, também são conduzidas usando P19 celular linha17,18, e acreditamos que o método desenvolvido neste estudo vai desempenhar um papel na elucidatação da mecanismos moleculares em anormalidades NEURODESENVOLVIMENTAIS e doenças neurodegenerativas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui, nós descrevemos um protocolo simples para a neurogênese usando a linha celular P19. Embora muitos relatórios tenham sido publicados a este respeito, uma metodologia detalhada para a indução da neurogênese usando a linha celular P19 permanece obscura. Além disso, utilizou-se um meio DMEM de glicose (4.500 mg/L) de alta simples com 10% de FBS para todo o experimento. Isso nos permitiu realizar o experimento neurogênico de forma amigável e ampliar o uso desse método para o futuro.
<p class="jove_content"…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O estudo foi apoiado financeiramente pelo National Science Centre, Polónia (n º de subvenção. UMO-2017/25/N/NZ3/01886) e KNOW (Centro Nacional de pesquisa líder) consórcio científico “alimentos saudáveis para animais seguros”, decisão do Ministério da ciência e do ensino superior n º 05-1/KNOW2/2015
Materials
| 6x DNA Loading Dye | EURx | E0260-01 | |
| Agarose | Sigma- Aldrich | A9539 | |
| cDNA synthesis kit | EURx | E0801-02 | |
| DAPI (4′,6-Diamidine-2′-phenylindole dihydrochloride) | Sigma- Aldrich | 10236276001 | Working concentration: 1 μg/mL |
| DMEM high glucose (4.5 g/L) with L-glutamine | Lonza | BE12-604Q | |
| Ethanol 99.8% | Chempur | CHEM*613964202 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | EURx | E5050-03 | |
| MAP2 antibody | Thermo Fisher Scientific | PA517646 | Dilution 1:100 |
| PCR reaction kit | EURx | E0411-03 | |
| Penicillin/Streptomycin 10K/10K | Lonza | DE17-602E | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 1x concentrated without Ca2+, Mg2+ | Lonza | BE17- 517Q | |
| Retinoic acid | Sigma- Aldrich | R2625-50MG | dissolved in 99.8% ethanol; store in -20 °C up to 6 months |
| Secondary Antibody (Alexa Fluor 488) | Thermo Fisher Scientific | A11034 | Dilution 1:500 |
| Skim milk | Sigma- Aldrich | 1153630500 | |
| TBE Buffer | Thermo Fisher Scientific | B52 | |
| Triton-X 100 | Sigma- Aldrich | T8787-100ML | |
| Trypsin 0.25% – EDTA in HBSS, without Ca2+, Mg2+,with Phenol Red | biosera | LM-T1720/500 | |
| Cell Culture Plastics | |||
| 1 mL Serological Pipettes | Profilab | 515.01 | |
| 10 mL Serological Pipettes | Profilab | 515.10 | |
| 100 mm dish dedicated for suspension culture | Corning | C351029 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Sigma- Aldrich | CLS430791-500EA | |
| 5 mL Serological Pipettes | Profilab | 515.05 | |
| 6-well plate | Corning | CLS3516 | |
| Cell culture flasks, surface area 25 cm2 | Sigma- Aldrich | CLS430639-200EA |
References
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