Neurogenes med P19 embryonala cancerceller

Summary

Den P19 mus embryonal carcinoma cellinjer (P19 cellinjer) används ofta för att studera den molekylära mekanismen för neurogenes med stor förenkling jämfört med in vivo analys. Här presenterar vi ett protokoll för retinoinsyra syra-inducerad neurogenes i P19 cell linjen.

Abstract

Den P19 cellinjer härrör från en mus embryo-derived teratocarcinom har förmågan att differentiera till de tre bakterie lagren. I närvaro av retinoinsyra syra (RA), den suspension odlade P19 cellinjer induceras för att differentiera till nervceller. Detta fenomen utreds utförligt som en neurogenes modell in vitro. Därför, den P19 cellinjer är mycket användbart för molekylära och cellulära studier i samband med neurogenes. Emellertid, protokoll för neuronala differentiering av P19 cellinjer som beskrivs i litteraturen är mycket komplexa. Den metod som utvecklats i denna studie är enkel och kommer att spela en roll i att belysa de molekylära mekanismerna i neurologiska utvecklingsstörningar och neurodegenerativa sjukdomar.

Introduction

Under embryonal utveckling, ett enda cellskikt omvandlas till tre separata bakterie skikt^1,2,3. För att öka forskningsmöjligheterna för fenomen som inträffar in vivo har generering av tredimensionella aggregat (embryonala kroppar) utvecklats som en praktisk modell. Cellulära aggregat bildas på detta sätt kan utsättas för olika förhållanden som orsakar celldifferentiering, som återspeglar utvecklingen av embryot^4,5. Den P19 murina embryonal carcinoma cell linje (P19 cellinjer) används ofta som en cellulär modell för neurogenes studier in vitro-^6,7,8. Den P19 cellinjer uppvisar typiska pluripotenta stamceller funktioner och kan differentiera till nervceller i närvaro av retinoinsyra (RA) under cell aggregering följt av neurit utväxt under anhängare villkor. Dessutom, den odifferentierade P19 cell linjen är också kapabel att bilda muskel-och kardiomyocyte-liknande celler under påverkan av dimetylsulfoxid (DMSO)^9,10,11,12.

Många metoder^13,14,15,16 har rapporterats för neuronala differentiering, men metoden är ibland komplicerat och inte lätt att förstå genom att bara läsa beskrivningarna. Till exempel, protokoll kräver ibland en kombination av Dulbecco modifierade Eagle medium (DMEM) medium kompletteras med en blandning av kalv serum (CS) och foster bovint serum (FBS)¹³. Dessutom, medier som används för neuronala utveckling består ofta av neurobasal och B27 kosttillskott^13,14,15,16. Som sådan, befintliga metoder innehåller komplexitet i deras beredning och vårt mål här är att förenkla protokollen. I denna studie, vi visade att DMEM med FBS kan utnyttjas för att upprätthålla P19 cellinjer (DMEM + 10% FBS) samt för neuronala utveckling (DMEM + 5% FBS + RA). Denna förenklade metod för neurogenes med hjälp av P19 cellinjer ger oss möjlighet att studera den molekylära mekanismen för hur neuroner utvecklas. Dessutom bedrivs även forskning om neurodegenerativa sjukdomar som Alzheimers sjukdom med hjälp av P19 cell linje^17,18, och vi anser att den metod som utvecklats i denna studie kommer att spela en roll i att belysa molekylära mekanismer i neurologiska utvecklingsstörningar och neurodegenerativa sjukdomar.

Protocol

1. underhåll av kulturen Odla P19 cellinjer i underhålls medium (Dulbecco ‘ s Modified Eagle ‘ s medium med 4 500 mg/L glukos kompletterat med 10% FBS, 100 enheter/mL penicillin och 100 enheter/mL streptomycin). Inkubera vid 37 ° c och 5% CO2. 2. subculturering av celler När cellerna når cirka 80% Confluence, ta bort det förbrukade mediet från cell odlings flaskans kolvar (yta 25 cm2). Tvätta cellerna med 2 mL fosfatbuffrad salt…

Representative Results

Den förenklade systematiken i protokollet för neurogenes induktion i P19 cellinjer presenteras i figur 1. För att definiera teckenet av den P19 cellen fodrar i ett odifferentierat påstå, och under Neurogenesis användes den RT-PCR (omvänd Transkription-Polymerase kedjar reaktion) metoden. Den odifferentierade P19 cellinaden uttryckte pluripotens gener såsom organisk katjon/karnitin transporter4 (Oct4) och nanog Hedgehog (nanog). Neuro…

Discussion

Här beskriver vi ett enkelt protokoll för neurogenes med hjälp av P19-celllinjen. Även om många rapporter har publicerats i detta avseende, en detaljerad metod för neurogenes induktion med P19 cellinjer är fortfarande oklart. Dessutom utnyttjade vi en enkel hög glukos (4 500 mg/L) DMEM medium med 10% FBS för hela experimentet. Detta tillät oss att utföra det neurogena experimentet på ett användarvänligt sätt och utöka användningen av denna metod för framtiden.

De mest kritisk…

Materials

6x DNA Loading Dye	EURx	E0260-01
Agarose	Sigma- Aldrich	A9539
cDNA synthesis kit	EURx	E0801-02
DAPI (4′,6-Diamidine-2′-phenylindole dihydrochloride)	Sigma- Aldrich	10236276001	Working concentration: 1 μg/mL
DMEM high glucose (4.5 g/L) with L-glutamine	Lonza	BE12-604Q
Ethanol 99.8%	Chempur	CHEM*613964202
Fetal Bovine Serum (FBS)	EURx	E5050-03
MAP2 antibody	Thermo Fisher Scientific	PA517646	Dilution 1:100
PCR reaction kit	EURx	E0411-03
Penicillin/Streptomycin 10K/10K	Lonza	DE17-602E
Phosphate Buffered Saline (PBS), 1x concentrated without Ca2+, Mg2+	Lonza	BE17- 517Q
Retinoic acid	Sigma- Aldrich	R2625-50MG	dissolved in 99.8% ethanol; store in -20 °C up to 6 months
Secondary Antibody (Alexa Fluor 488)	Thermo Fisher Scientific	A11034	Dilution 1:500
Skim milk	Sigma- Aldrich	1153630500
TBE Buffer	Thermo Fisher Scientific	B52
Triton-X 100	Sigma- Aldrich	T8787-100ML
Trypsin 0.25% – EDTA in HBSS, without  Ca2+, Mg2+,with Phenol Red	biosera	LM-T1720/500
Cell Culture Plastics
1 mL Serological Pipettes	Profilab	515.01
10 mL Serological Pipettes	Profilab	515.10
100 mm dish dedicated for suspension culture	Corning	C351029
15 mL centrifuge tubes	Sigma- Aldrich	CLS430791-500EA
5 mL Serological Pipettes	Profilab	515.05
6-well plate	Corning	CLS3516
Cell culture flasks, surface area 25 cm2	Sigma- Aldrich	CLS430639-200EA