Summary
Mycobacterium tuberculosis antijenleri için serolojik tanı testlerini geliştirmek için ekstrapulmoner tüberkülozu tespit etmek için süperparamanyetik demir oksit nanoprobları geliştirdik.
Abstract
Süperparamanyetik demir oksit (SPIO) nano partikülleri ve Mycobacterium tuberculosis yüzey antikorlarından (MtbsAb) oluşan moleküler görüntüleme sondası, ekstrapulmoner tüberküloz (ETB) için görüntüleme hassasiyetini artırmak için sentezlendi. Bir SPIO nanoprobub sentezlendi ve MtbsAb ile konjuge edildi. Saflaştırılmış SPIO-MtbsAb nanoprobutem ve NMR kullanılarak karakterize edildi. Sondanın hedefleme yeteneğini belirlemek için SPIO-MtbsAb nanoprobları in vitro görüntüleme tahlilleri için Mtb ile kuluçkaya yatırıldı ve manyetik rezonans (MR) ile in vivo araştırma için Mtb-inoprole farelere enjekte edildi. Mtb ve THP1 hücrelerinin manyetik rezonans görüntüleme (MRG) kontrast geliştirme azaltma SPIO-MtbsAb nanoprob konsantrasyonu ile orantılı gösterdi. Mtb enfekte fareleriçine intravenöz SPIO-MtbsAb nanoprobe enjeksiyon 30 dakika sonra, granülomatöz sitenin sinyal yoğunluğu 14 kat T2 ağırlıklı MR görüntüleri ile pbs enjeksiyonu alan fareler ile karşılaştırıldığında geliştirilmiştir. MtbsAb nanoprobları ETB tespiti için yeni bir yöntem olarak kullanılabilir.
Introduction
Küresel olarak, ekstrapulmoner tüberküloz (ETB) tüberküloz (TB) olgularının önemli bir oranını temsil eder. Bununla birlikte, ETB tanısı genellikle cevapsız veya gecikmiş nedeniyle sinsi klinik sunum ve tanı testlerinde kötü performans; yanlış sonuçlar arasında asit hızlı basiller için negatif balgam yaymaları, histopatolojide granülomatöz doku eksikliği veya Kültür Mycobacterium tuberculosis 'in (Mtb) başarısızlığı sayılabilir. Tipik vakalara göre, ETB daha az sıklıkta ortaya çıkar ve Mtb basilinin çok az serbestliğini içerir. Buna ek olarak, genellikle lenf düğümleri, plevra ve osteoartiküleralanlar1 gibi ulaşılabilmek zor sitelerde lokalize edilir. Bu nedenle, bakteriyolojik doğrulamariskli ve zor kılan yeterli klinik örneklerin elde edilmesi için invaziv prosedürler, gerekli2,3,4.
ETB için ticari olarak mevcut antikor algılama testleri klinik algılama için güvenilmez çünkü duyarlılık geniş bir yelpazede (0.00-1.00) ve özgüllük (0.59-1.00) kombine tüm ekstrapulmoner siteler için5. Enzime bağlı immünspot (ELISPOT) interferon-γ, kültür filtrat proteini (CFP) ve erken salgı antijenik hedef (ESAT) için tahliller gizli ve aktif Tüberküloz tanısı için kullanılmıştır. Ancak, sonuçlar ETB tanısı için farklı hastalık siteleri arasında değişir6,7,8. Buna ek olarak, cilt PPD (saflaştırılmış protein türevi) ve QuantiFERON-TB sık yanlış negatifsonuçlar9 sağladı. QuantiFERON-TB-2G etkilenen organdan bir örnek gerektirmez ve bu alternatif bir tanıaracı6 olabilir tam bir kan immün reaktivite tahlili,10,11. Genellikle TB menenjit için kullanılan diğer tanı yöntemleri, polimeraz zincir reaksiyonu gibi, hala çok emin klinik tanı dışlamak için duyarsız12,13. Bu konvansiyonel testler ekstrapulmoner enfeksiyon bölgesini keşfetmek için yeterli tanısal bilgi göstermez. Bu nedenle, yeni tanı yöntemleri klinik olarak gereklidir.
Moleküler görüntüleme, vivo14,15'tehastalık süreçlerinin spesifik moleküler hedeflerini doğrudan tarayabilen yeni araçlar tasarlamayı amaçlamaktadır. Süperparamanyetik demir oksit (SPIO), Bir T2 ağırlıklı NMR kontrast ajan, önemli ölçüde özgüllük ve manyetik rezonans duyarlılığı artırabilir (MR) görüntüleme (MRG)16,17. Bu yeni fonksiyonel görüntüleme yöntemi, ligand-reseptör etkileşimleri yoluyla doku değişikliklerini moleküler düzeyde tam olarak çizebilir. Bu çalışmada, SPIO nano partiküllerinden oluşan yeni bir moleküler görüntüleme sondası, ETB tanısı için Mtb yüzey antikor (MtbsAb) ile eşleşecek şekilde sentezlendi. SPIO nanoproblar muayene altında doku ve organları minimal invaziv18,19. Ayrıca, bu nanoproblar paramanyetik özellikleri nedeniyle düşük konsantrasyonlarda hassas MR görüntüleri gösterebilir. Buna ek olarak, SPIO nanoproblar demir iyonlarının varlığı normal fizyolojinin bir parçası olduğu için en az alerjik reaksiyonlar ortaya çıkargörünür. Burada ETB'yi hedef alan SPIO-MtbsAb nanoproblarının duyarlılığı ve özgüllüğü hem hücre hem de hayvan modellerinde değerlendirildi. Sonuçlar, nanoprobların ETB tanısı için ultra duyarlı görüntüleme ajanları olarak uygulanabilir olduğunu göstermiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvan deneyi ile ilgili tüm protokol, Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı için Ulusal Sağlık Enstitüleri Yönergeleri uyarınca laboratuvar hayvanı ıslahı için standart çalışma prosedürlerini izler ve kurumsal hayvan bakım ve kullanım komitesi.
1. SPIO nanopartikül sentezi
- Dekstran T-40 (5 mL; %50 w/w) ve sulu FeCl3×6H2O (0,45 g; 2,77 mmol) ve FeCl2×4H2O (0,32 g; 2,52 mmol) çözeltilerini oda sıcaklığında şiddetle karıştırarak dekstran kaplı demir oksit manyetik nano partikülleri hazırlayın.
- NH4OH (10 mL; %7,5 v/v) hızla ekleyin.
- Daha fazla 1 saat için siyah süspansiyon karıştırın; daha sonra, 10 dakika için 17.300 x g santrifüj ve daha sonra agregaları kaldırın.
- Jel filtrasyon kromatografisi20ile son SPIO ürünlerini bağlanmamış dekstran T-40'tan ayırın.
- Reaksiyon karışımını (toplam hacim = 5 mL) 2,5 cm × 33 cm'lik bir kolona yükleyin ve pH 7,0'da 0,1 M Na asetat ve 0,15 M NaCl içeren bir tampon çözeltisi ile elitedin.
- Void hacminde saflaştırılmış dekstran kaplı demir oksit manyetik nano tanecikleri toplamak ve kolon hidroklorik asit ve fenol / sülfürik asityöntemlerikullanarak 330 ve 490 nm demir ve dekstran için eluates tahmin, sırasıyla.
2. SPIO-MtbsAb sentezi
- Synthesize SPIO-konjuge EDBE daha önce bildirilen yöntemler kullanılarak21,22.
- Synthesize SPIO-EDBE-succinic anhidrit (SA).
- 24 saat oda sıcaklığında SPIO-EDBE ve SA (1 g; 10 μmol) alkali çözeltisini (5 M NaOH; 10 mL)) karıştırın.
- Moleküler gözenekli membran borusu (12.000-14.000 MW kesme) kullanarak 2 L distile su 20 L değişiklikler ile çözelti diyaliz. Her değişiklik için 6 saat.
- Son olarak, SPIO-MtbsAb'ı kullanarak sentezlemek için 400 μL 400 mg/mL MtbsAb'ye 100 μL SPIO-EDBE-SA (4 mg/mL Fe) ekleyin 1-hidroksibenzotriazol ve (benzotriazol-1-yloxy) tripyrrolidinofosfonium hexafluorophosphate katalizör olarak ve 24 saat oda sıcaklığında çözelti karıştırın.
- Son olarak, jel filtrasyon kromatografisi ile bağlanmamış antikordan çözeltileri ayırın.
- Reaksiyon karışımını (5 mL) 2,5 cm × 33 cm kolona yükleyin ve PBS tamponu kullanarak elte olun. Ab-nanopartikül kompleksi (yani, nanoprob) bir bicinchoninic asit protein asit araştırma kiti kullanarak onaylamak23.
3. Parçacık morfolojisi gözlem ve gevşeme kademeölçümü
- 100 kV'luk bir voltajda iletim elektron mikroskobu kullanarak ortalama parçacık boyutunu, morfolojisini ve boyut dağılımını inceleyin.
- Kompozit dağılımını 200 örgülü bakır ızgaraya bırakın ve mikroskoba yüklemeden önce oda sıcaklığında kuruhava.
- 20 MHz ve 37.0 °C ± 0.1 °C'de NMR relaxometresini kullanarak nanoprozların gevşeme süresi değerlerini(T1 ve T2)ölçün.
- Her ölçümden önce relaxometreyi kalibre edin.
- R 1 ve r2 relaxivitelerini belirlemek için, sırasıyla, tersine çevirme-kurtarma ve Carr-Purcell-Meiboom-Gill darbe dizisi ile oluşturulan sekiz veri noktasından r 1 ve r2 değerlerinikaydedin.
4. Hücre görüntüleme
- RPMI 1640'ta %10 fetal sığır serumu, 50 g/mL gentamisin sülfat, 100 ünite/mL penisilin G sodyum, 100 μg streptomisin sülfat ve %5 CO2 inkuvtorda 0,25 μg/mL fungizone ile insan monositleri THP-1'i yetiştirin.
- Incubate SPIO-MtbsAb nanoproblar (2 mM) ile 106 koloni şekillendirme birimleri (CFU) Mycobacterium bovis BCG ile preincubated 1 × 107 aktif monositmikrocentrifuge tüpler (1 mL) bir 5% CO2 kuluçka içinde 37 ° c için 1 saat.
- 200 x g centrifuge tüpleri ve supernatant atın. Pelletleri ortamda yeniden çözün (200 μL).
- Hızlı degrade lisanlı yankı darbesi dizisi (Tekrarlama süresi (TR) = 500 kullanarak örnekleri taziz; Yankı süresi(TE) = 20; Çevirme açısı = 10°) ile 3.0-T MRG ile nanoprobun özgüllüğünü ve hassasiyetini belirlemek için21,22.
5. BCG (Bacillus Calmette-Guérin) aşılama
- Sauton's orta lyophilized aşı veya bakteri stok yeniden ve daha önce açıklandığı gibi düzgün dağıtılana kadar tuzlu su ile stok seyreltmek24.
- ADIMMUNE (Taipei, Tayvan) (Connaught suş elde M. bovis BCG, canlı zayıflatılmış suşu inoculate; ImmuCyst Aventis, Pasteur Mérieux) 0.1 mL/fare hacminde (yani, 107 CFU) farelerin sol veya sağ dorsal skapular deri içine intradermally, daha önce açıklandığı gibi23. Negatif kontrol olarak farelere tuzlu su enjekte edin. BCG aşısından sonra hayvanları günlük olarak izleyin.
- Karbondioksit ötanazi kullanarak bakteri aşılama 1 ay sonra hayvanları kurban. Dokuları intradermal aşılama bölgesinden alın. 5-10 μm. Asit hızlı bakteriler için hematoksilin / eozin ve Ziehl-Neelsen lekeleri ile leke doku bölümleri ile seri bölümler için 10% formalin ve parafin gömmek doku düzeltin24 ve ferrik demir için Berlin maviile 25.
6. In vivo MRG
- Hayvan anestezisi için farelere ketamin (80 mg/kg vücut ağırlığı) ve ksilazin (12 mg/kg vücut ağırlığı) deri altı enjekte edin.
- SpiO-TbsAb problarını (2 nmol/200 μL) farelerin kuyruk damarlarına enjekte edin. MR görüntü fareler önce ve hemen prob enjeksiyonu sonra ve daha sonra her 5 dk için 30 dk T2 ağırlıklı hızlı spin-yankı görüntüleri elde etmek için (TR = 3000; TE = 90; görüş alanı = 8).
- Bir Mtb granülom merkezinin ve granülomatöz alana bitişik arka kanın karşılaştırılabilir konumlarında tanımlanmış ilgi bölgelerinin ölçümü olan sinyal yoğunluğu (SI) kullanarak tüm MR görüntülerini nicel olarak analiz edin.
- Formülü kullanarak kontrast maddelerin (SIpre; kontrol) ve 0-3 h (SIpost) enjeksiyonundan önce SI ölçümü kullanarak göreli sinyal geliştirmelerini hesaplayın
[(SIpost - SIpre)/SIpre] × 100
nerede SIpre önceden geliştirilmiş tsam üzerinde lezyonun SI ve SIpost post-enhanced tcan21,22üzerinde lezyonun SI olduğunu .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
SPIO-MtbsAb nanoprob sentezi ve karakterizasyonu
SPIO nano tanecikleri MtbsAb ile biraraya getirmek için tasarlanmıştır. SPIO nano taneciklerinin yüzeyinde stabilize dekstran epiklorohidrin ile çapraz bağlandı. SPIO nano tanecikleri daha sonra dextran uçlarında birincil amin fonksiyonel grupları etkinleştirmek için EDBE ile dahil edildi. SA daha sonra SPIO-EDBE-SA oluşturmak için konjuge edildi. SPIO-MtbsAb nanoprobları, MtbsAb'ın SPIO-EDBE-SA ile kaplin ajanlarının varlığında çekimi ile son adımda oluşmuştur. SPIO-MtbsAb nanoproblarının TEM görüntüsü(Şekil 1),SPIO-MtbsAb nanoproblarının iyi dağılmış bir görünüme sahip olduğunu göstermektedir. SPIO-MtbsAb nanoprob çekirdeğinin ortalama boyutu 3.8 ± 0.4 nm (200 parçacık hesaplaması) idi.
Sulu çözeltide, nanoprozların r1 ve r2, gevşetme değerleri sırasıyla 23 ± 3 ve 151 ± 8 mM -1 s-1idi, sırasıyla 20 MHz ve 37.0 °C ± 0.1 °C idi. SPIO-MtbsAb nanoproblarının r1/r2 oranı Resovist'inkine benzerdi; ancak Resovist'in r1 ve r2'si (sırasıyla 26 ve 164 mM-1s-1)SPIO-MtbsAb nanoproblarından biraz daha yüksekti.
In vitro SPIO-MtbsAb nanoprobuk karakterizasyonu ve görüntüleme
İlk olarak, Ziehl-Neelsen boyama yoluyla asit hızında bir bakteri olan M. bovis BCG tespit ettik (Şekil 2A). Bakteriler izole edildi ve daha sonra ferrik demir içeren problar ile kültürlü, Berlin mavi boyama ile tanımlanabilir(Şekil 2B). SPIO-MtbsAb nanoprobunun Mtb hedefleme derecesi T2 ağırlıklı MRG ile belirlenmiştir; negatif geliştirme bakteri hücresine bağlı probların miktarı ile orantılıydı. Nanoprobların varlığında SI'deki azalma konsantrasyona bağlı bir şekilde meydana geldi (Şekil 2C). 2, 1 ve 0,5 mM'de, Mtb ile konjuge edilen nanoprozlar sırasıyla 97,67 ± 3,05, 131,67 ± 4,51 ve 257,33 ± 5,03'lük SI'ler sergilenmiştir ve bunların hepsi 1 mM konjuge olmayan nanosonda için 90,75 ± 2,47'nin daha yüksek si'si olarak sergilenmiştir. PBS (SI = 1073,43 ± 13,62) ile karşılaştırıldığında, sadece TB grubunda hemen hemen hiç sinyal azaltma kaydedilememiştir (SI = 957,33 ± 12,53). Böylece, SPIO probları özellikle Mtb basilini hedef aldı; dahası, gelişmiş MR görüntüleri, SI SPIO nano tanecikleri miktarında artış ile azaldı.
Benzer şekilde, gelişmiş MR görüntüleri SI azalmalar 1 saat nanoprozlar ile THP-1 monositlerin kültürlenme sonra kaydedildi. 1 mM (SI = 225,33 ± 8,58) ve 2 mM (SI = 104 ± 2,16) konsantrasyonlarının sadece PBS ile uygulanan gruplara göre istihdam edildiğinde (SI = 1005,33 ± 16,74) veya nanopr ile uygulanmadığında TB grubunun SI'sinde önemli bir azalma kaydedildi. obe (SI = 991 ± 8.98). Mtb gruplarında 1 ve 2 mM nanoprob için MRG SI azalması, pozitif 1 mM nanoprobud tek başına grupta (SI = 112,33 ± 3,68) karşılaştırılabilir di. Yukarıdaki sonuçlara göre, SPIO-MtbsAb nanoproblar nanoprobe-aktive THP-1 monosit kaçakçılığı izleme yardımcı olabilir.
In vivo SPIO-MtbsAb nanoprob görüntüleme
Hücre görüntülemeden sonra ETB için in vivo MRG'nin etkinliğini belirledik. SPIO-MtbsAb nanoprobları Mtb ile enfekte olmuş farelere intravenöz olarak enjekte edildi. Enjeksiyondan 0.5 saat sonra Mtb granülomatöz bölgesinde açıkça saptanabilen MR sinyali belirtilmiştir; ancak, arka plan için en yüksek SI enjeksiyon 1 saat sonra gözlendi. Mtb granülomatöz bölgesinde MR sinyalizasyonunda önemli bir azalma kaydedildi(Şekil 3). SI, (SIpre) ve sonrası (SIpost) kontrast madde enjeksiyonundan önce ve sonra ölçüldü. Prob enjeksiyonundan bir saat sonra, Mtb granülamatöz bölgelerdeki Sinyal azaltmanın T2 ağırlıklı geliştirmesi(Şekil 3B)kontrol bölgelerindekinden yaklaşık 14 kat daha yüksekti (Şekil 3A; -%1,68 ± %1,32 ve -%23,43 ± % 7,24; p < 0.001).
SPIO-MtbsAb nanoproblarının histolojik ve immünohistokimyasal değerlendirilmesi
C57BL/6 farelerinde enfeksiyondan 1 ay sonra deri altı granülom gelişti. Bu lezyonlarda lenfosit ve epiteloid-makrofaj agregaları ile birlikte yeni kan vaskülarizasyonu saptandı. Organize granülom giderek büyümüştü (Şekil 4A). TB lezyonlarının SPIO-MtbsAb MR sinyalleri ile korelasyonu, Mtb yüzey antijeninin anti-MtbsAb ile immünohistokimyasal reaksiyonu ile daha da belirlendi. Pozitif MtbsAb ekspresyonu granülomatöz alanlarda(Şekil 4B),lezyon bölgesinde pozitif asit hızlı basil boyama ile saptandı (Şekil 4C). Berlin mavisi, ferrik demir pozitif bir leke, Mtb. Berlin mavi-pozitif SPIO sondası için sondaduyarlılığını belirlemek için kullanılmıştır MtbsAb ile aynı yerde bulundu (Şekil 4D). Tüm kolokalize çiftler Şekil 4A-D'degösterilmiştir.
Şekil 1: TEM'deki SPIO-MtbsAb nanoproblarının ortalama çekirdek boyutu. SPIO-MtbsAb nanoprobuk çekirdeğinin ortalama boyutu 3.8 ± 0.4 nm idi ve TEM görüntü analizi (200 parçacık hesaplaması) ile ölçüldü. Ölçek çubuğu = 15 nm. Bu rakam öncekiçalışmamız26'dandeğiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: SPIO-MtbsAb nanoprobun in vitro karakterizasyonu. Asit hızlı basiller (A) Ziehl-Neelsen boyama ve (B) ile nanoprobun ferrik demirinin Berlin mavisi boyama yoluyla tanımlanan bakterilere konjugasyonu ile tanımlanır. (C) SPIO-MtbsAb nanoprobları Mtb ile inkübe edildikten sonra negatif geliştirme gösteren T2 ağırlıklı MRG. (2) 97,67 ± 3,05 (Mtb + 2,0 mM Prob); (3) 131,67 ± 4,51 (Mtb +1,0 mM Prob); (4) 257,33 ± 5,03 (Mtb + 0,5 mM Prob); (5) 957,33 ± 12,53 (Mtb +0 mM Prob); (6) 1073,43 ± 13,62 (PBS). PBS kontrol grubunda tespit edilebilir sinyal azaltma kaydedilemez. (D) Nanoproblarla kuluçkadan sonra THP-1 monositlerinde doza bağlı negatif geliştirme 1 saat. (C) ve (D) ölçek çubukları 5 mm'dir. Bu rakam öncekiçalışmamız26'dandeğiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: C57BL/6 farenin deri altı ETB lezyonlarında in vivo SPIO-MtbsAb nanoprobları. (A) Kontrol ve (B) Mtb granülomatöz alanlar. Mtb granülomatöz bölgelerde, probu uygulamasından sonra kontrol alanları ile karşılaştırıldığında MR sinyalizasyonunda 14 kat azalma görülür (-1.68% ± %1.32 vs. -23.43% ± 7.24%, p < 0.001). Sonuçlar ± SD'ler olarak verilir. İki kuyruklu öğrencinin t-testleri kullanılan istatistiksel karşılaştırmalar. p < 0.05 önemli olarak kabul edildi. Bu rakam öncekiçalışmamız26'dandeğiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Histoloji, immünohistokimya, asit hızında ve Berlin mavi boyama korelasyonları. Mtb granülomatöz alanların histolojisi ağırlıklı olarak lenfositler ve epiteloid makrofajlar gösterir. Bu lezyonlarda nevasaskülaralizasyon ve lenfositlerin ve epiteloid makrofajların bol agregasyonu gözlendi. (A) Organize granülomlar giderek gelişir. (B) Granülomatöz lezyonlarda MtbsAb ekspresyonunu gösteren immünohistokimyasal boyama,(C) asit hızlı basilleri ise aynı bölgelere dağılır. (D) Berlin mavi boyama SPIO probları kolokalize MtbsAb alanlarda bulunur. Ferrik demir için Berlin mavi boyama Mtb. Ölçek çubukları 100 μm prob konjugasyon gösterir. Bu rakam öncekiçalışmamız26'dandeğiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
İlgili çalışmalara benzer şekilde, SPIO-MtbsAb nanoprobları ile ilgili bulgularımız Mtb27,28için önemli bir özgüllük göstermiştir. Fare modellerinde tb enjeksiyonundan 1 ay sonra deri altı Mtb granülomu bulundu. Tipik Tüberküloz granülomatöz histoloji bulguları lenfosit infiltrasyonu, epiteloid makrofajvarlığı ve nevasaskülarizasyon dur. Asit hızlı basiller Tüberküloz lezyonlarına dağıldı ve MtbsAb immünohistokimya bulgularını doğruladı. Bu, Mtb yüzey antijeni ve MtbsAb arasında immünolojik bir reaksiyon olduğunu göstermiştir. Berlin mavisi MtbsAb ile aynı alanları vurgulayarak, sondaların asit hızındaM'la çekim özgüllüğünü doğruladı.
Özellikle, Mtb ve monositik THP1 hücreleri için MRG negatif kontrast geliştirme ölçüde SPIO-MtbsAb nanoprob konsantrasyonu ile orantılı idi. Mtb granülomları taşıyan farelere SPIO-MtbsAb nanoprobları verildiğinde, T2 ağırlıklı MR görüntülerinde PBS enjeksiyonlu karşıt bir bölgeye kıyasla granülomatöz bölgede 14 kat sinyal azaltma kaydedildi. Bu, kontrast maddenin önemli bir birikimini gösterir. Sonuçlar kontrast madde belirli hedefleme elde etmek için bir olasılık göstermektedir, hangi klinik tanı için doz gereksinimini azaltabilir.
Bulgularımız bu nanoprobların Mtb granülomatöz lezyonlarda saptanabilir bir hacim biriktirdiğini göstermektedir. Bu sonuçlar anti-hMtbsAb kullanarak bir SPIO nanoprobuf geliştirerek teyit edilebilir. SPIO'nun manyetik demir oksit çekirdeği MRG kontrast maddelerinde T2 kısalması için uygulandığından, bulgular klinik tanı uygulamaları için benzer hücre davranışlarını saptamak için pratik ve noninvaziv bir yaklaşım göstermektedir.
Burada 2 bölümden oluşan protokolü salıyoruz: 4-6. Bu teknikler hücre ekimi, hayvan deneyleri ve optik görüntülemeyi kapsamaktadır. Bölüm 1'den 3'e kadar sonda sentezleridir. Bazı kritik adımlar denemeyi çoğaltmaya yardımcı olur. SPIO nanopartikül sentezinin kritik adımı bir dekstran kaplı demir oksit manyetik nano tanecikleri hazırlamaktır; dextran T-40, sulu FeCl3-6H2O ve FeCl2-4H2O solüsyonlarını oda sıcaklığında kuvvetle karıştırmak ve tamamen karıştırmak çok önemlidir. Bölüm 2 için kritik adım, SPIO-MtbsAb sentezi,SPIO-EDBE-SA spio-MtbsAb sentezlemek için MtbsAb konjuge olduğunu. Uygun katalizörleri seçmek ve çözeltiyi oda sıcaklığında yeterince karıştırmak da önemlidir. Ve bölüm 3, Parçacık morfolojisi gözlem ve gevşeme katmanı ölçümü için kritik adım, her ölçüm den önce relaxometre kalibre etmektir. Probların boyutunu tam olarak hesaplamak için, gevşeticimetrenin kalibrasyonu da çok önemlidir.
Bu çalışmada M. bovis BCG ve tavşan anti-Mtb kullanılmıştır. Büyükbaş ve tavşan kaynaklarının çapraz reaktivitesi hafif kabul edildi, ancak veriler MtbsAb konjuge SPIO'nun M. bovis BCG ile güçlü etkileşimler ortaya çıktığını kanıtladı. Bulgularımız SPIO nanoproblarının özellikle tüberkülozu hedef lediğini gösteriyordu. Nanoprob ve Mtb bakterilerin inkübasyonu doza bağlı olarak negatif bir geliştirme şekli gösterirken, MRG'de SPIO nanoprobes için gözlenen geliştirmedeki azalma SPIO parçacıklarının varlığıyla ilişkiliydi. Verilerimize dayanarak, nanoprobun özgüllüğünü artırmak için olası antikor çekim yaklaşımlarını araştırmak için daha fazla araştırma yapılmasını memnuniyetle karşılayabilmek isterim.
Önceki çalışmalar SPIO bu çalışmada kullanılan bir konsantrasyonda hücre aktivitesini değiştirmeden minimal sitotoksisite gösterir göstermektedir29,30. Önceki araştırmalarla uyum içinde, sonuçlarımız SPIO nanoproblarının THP-1 hücrelerine en az etkisini gösterdi. THP-1 hücreleri 1 saat boyunca bakteri çekimi ile SPIO nanoprobları ile kuluçkaya yatırıldı. SI, mtb gruplarında 1 mM veya 2 mM nanoprob konsantrasyonu ile önemli bir düşüş gösterdi, nanoprob tedavisi veya PBS olmadan kontrol grubu ile karşılaştırıldığında tek başına. Sonuç SPIO nanoprobun güvenliğini destekler ve nanoprobun hassasiyetini doğrulamak için diğer bakteri yüklerini uygulayan daha fazla çalışma memnuniyetle karşılanır.
Çalışmamızın bir sınırlaması, farelerdeki SPIO-MtbsAb nanoprobunun biyodağılımını ölçmediğimizdi. Ayrıca, nanoprobun intravasküler yarılanma ve karaciğer birikimini araştırmadık, bu da probların Mtb lezyonlarında bulunan THP-1 hücrelerine maruz kalma süresini değiştirebilir. Biyolojik bozunma konusunda daha fazla araştırma yapılması gerekmektedir. Ayrıca, MRG SPIO nanoprobların özellikle bakteri veya monositlere bağlanıp bağlanamayacağını veya bu probların endositolup olmadığını ayırt edemedi.
Sonuç olarak, biyouyumlu SPIO-MtbsAb nanoprobları hazırlamak ve karakterize etmek için net ve uygulanabilir bir protokol geliştirdik. Bu nanoproblar hidrofiliktir ve fizyolojik koşullar altında iyi dağılım; düşük konsantrasyonlarda minimal sitotoksiktirler. Ayrıca, bu SPIO-MtbsAb nanoprobları, in vitro ve in vivo çalışmalarımızda gösterildiği gibi Mtb enfeksiyonunun hedeflenebilmesini ve saptanmasını sağlar. Böylece, SPIO-MtbsAb nanoproblar ETB tespiti için MRG kontrast maddeler olarak uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların hiçbiri bu çalışmada incelenen malzemelerherhangi bir özel ilgi vardır.
Acknowledgments
Yazarlar Ekonomi Bakanlığı Tayvan mali destek için müteşekkir (verir NSC-101-2120-M-038-001, MOST 104-2622-B-038 -007, MOST 105-2622-B-038-004) bu araştırma çalışması gerçekleştirmek için. Bu el yazması Wallace Akademik Düzenleme tarafından düzenlenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (benzotriazol-1-yloxy) tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate | Sigma-Aldrich | ||
| 1-hydroxybenzotriazole | Sigma-Aldrich | ||
| dextran(T-40) | GE Healthcare Bio-sciences AB | ||
| epichlorohydrin, 2,2'-(ethylenedioxy)bis(ethylamine) | Sigma-Aldrich | ||
| ferric chloride hexahydrate | Fluka | ||
| ferrous chloride tetrahydrate | Fluka | ||
| Human monocytic THP-1 | |||
| M. bovis BCG | Pasteur Mérieux | Connaught strain; ImmuCyst Aventis | |
| MRI | GE medical Systems | 3.0-T, Signa | |
| NH4OH | Fluka | ||
| NMR relaxometer | Bruker | NMS-120 Minispec | |
| Sephacryl S-300 | GE Healthcare Bio-sciences AB | ||
| Sephadex G-25 | GE Healthcare Bio-sciences AB | ||
| SPECTRUM molecular porous membrane tubing, 12,000 -14,000 MW cut off | Spectrum Laboratories Inc | ||
| TB surface antibody- Polyclonal Antibody to Mtb | Acris Antibodies GmbH | BP2027 | |
| transmission electron microscope | JEOL | JEM-2000 EX II |
References
- Small, P. M., et al. Treatment of tuberculosis in patients with advanced human immunodeficiency virus infection. New England Journal of Medicine. 324, 289-294 (1991).
- Alvarez, S., McCabe, W. R. Extrapulmonary tuberculosis revisited: a review of experience at Boston City and other hospitals. Medicine. 63, Baltimore. 25-55 (1984).
- Ozbay, B., Uzun, K. Extrapulmonary tuberculosis in high prevalence of tuberculosis and low prevalence of HIV. Clinics in Chest Medicine. 23, 351-354 (2002).
- Ebdrup, L., Storgaard, M., Jensen-Fangel, S., Obel, N. Ten years of extrapulmonary tuberculosis in a Danish university clinic. Scandinavian Journal of Infectious Diseases. 35, 244-246 (2003).
- Steingart, K. R., et al. A systematic review of commercial serological antibody detection tests for the diagnosis of extrapulmonary tuberculosis. Postgraduate Medical Journal. 83, 705-712 (2007).
- Liao, C. H., et al. Diagnostic performance of an enzyme-linked immunospot assay for interferon-gamma in extrapulmonary tuberculosis varies between different sites of disease. Journal of Infection. 59, 402-408 (2009).
- Kim, S. H., et al. Diagnostic usefulness of a T-cell based assay for extrapulmonary tuberculosis. Archives of Internal Medicine. 167, 2255-2259 (2007).
- Kim, S. H., et al. Diagnostic usefulness of a T-cell-based assay for extrapulmonary tuberculosis in immunocompromised patients. The American Journal of Medicine. 122, 189-195 (2009).
- Pai, M., Zwerling, A., Menzies, D. Systematic review: T-cell-based assays for the diagnosis of latent tuberculosis infection: an update. Annals of Internal Medicine. 149, 177-184 (2008).
- Kobashi, Y., et al. Clinical utility of a T cell-based assay in the diagnosis of extrapulmonary tuberculosis. Respirology. 14, 276-281 (2009).
- Paluch-Oles, J., Magrys, A., Kot, E., Koziol-Montewka, M. Rapid identification of tuberculosis epididymo-orchitis by INNO-LiPA Rif TB and QuantiFERON-TB Gold In Tube tests: case report. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 66, 314-317 (2010).
- Kaneko, K., Onodera, O., Miyatake, T., Tsuji, S. Rapid diagnosis of tuberculous meningitis by polymerase chain reaction (PCR). Neurology. 40, 1617 (1990).
- Bhigjee, A. I., et al. Diagnosis of tuberculous meningitis: clinical and laboratory parameters. International Journal of Infectious Diseases. 11, 348-354 (2007).
- Miyawaki, A., Sawano, A., Kogure, T. Lighting up cells: labelling proteins with fluorophores. Nature Cell Biology. , Suppl 1-7 (2003).
- Weissleder, R., Mahmood, U.
- Gupta, A. K., Gupta, M. Synthesis and surface engineering of iron oxide nanoparticles for biomedical applications. Biomaterials. 26, 3995-4021 (2005).
- Talelli, M., et al. Superparamagnetic iron oxide nanoparticles encapsulated in biodegradable thermosensitive polymeric micelles: toward a targeted nanomedicine suitable for image-guided drug delivery. Langmuir. 25, 2060-2067 (2009).
- Cho, W. S., et al. Pulmonary toxicity and kinetic study of Cy5.5-conjugated superparamagnetic iron oxide nanoparticles by optical imaging. Toxicology and Applied Pharmacology. , 106-115 (2009).
- Mahmoudi, M., Simchi, A., Milani, A. S., Stroeve, P. Cell toxicity of superparamagnetic iron oxide nanoparticles. Journal of Colloid and Interface Science. 336, 510-518 (2009).
- Chen, T. J., et al. Targeted folic acid-PEG nanoparticles for noninvasive imaging of folate receptor by MRI. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 87, 165-175 (2008).
- Chen, T. J., et al. Targeted Herceptin-dextran iron oxide nanoparticles for noninvasive imaging of HER2/neu receptors using MRI. Journal of Biological Inorganic Chemistry. 14, 253-260 (2009).
- Weissleder, R., et al. Ultrasmall superparamagnetic iron oxide: an intravenous contrast agent for assessing lymph nodes with MR imaging. Radiology. 175, 494-498 (1990).
- Wang, J., Wakeham, J., Harkness, R., Xing, Z. Macrophages are a significant source of type 1 cytokines during mycobacterial infection. Journal of Clinical Investigation. 103, 1023-1029 (1999).
- Angra, P., Ridderhof, J., Smithwick, R. Comparison of two different strengths of carbol fuchsin in Ziehl-Neelsen staining for detecting acid-fast bacilli. Journal of Clinical Microbiology. 41, 3459 (2003).
- Woods, A. E., Ellis, R. Laboratory Histopathology- A Complete Reference. 1st edn. , Churchill Livingstone. 6-11 (1994).
- Lee, C. N., et al. Super-paramagnetic iron oxide nanoparticles for use in extrapulmonary tuberculosis diagnosis. Clinical Microbiology and Infection. 18, 149-157 (2012).
- Lee, H., Yoon, T. J., Weissleder, R. Ultrasensitive detection of bacteria using core-shell nanoparticles and an NMR-filter system. Angewandte Chemie International Edition. 48, 5657-5660 (2009).
- Fan, Z., et al. Popcorn-shaped magnetic core-plasmonic shell multifunctional nanoparticles for the targeted magnetic separation and enrichment, label-free SERS imaging, and photothermal destruction of multidrug-resistant bacteria. Chemistry. 19, 2839-2847 (2013).
- Nishie, A., et al. In vitro imaging of human monocytic cellular activity using superparamagnetic iron oxide. Computerized Medical Imaging and Graphics. 31, 638-642 (2007).
- von Zur Muhlen, C., et al. Superparamagnetic iron oxide binding and uptake as imaged by magnetic resonance is mediated by the integrin receptor Mac-1 (CD11b/CD18): implications on imaging of atherosclerotic plaques. Atherosclerosis. 193, 102-111 (2007).
