En detaljeret protokol for samtidige gennemførelsen af 48 parallelle cellekulturer under varierede forhold i et microbioreactor system er præsenteret. Celle kultur proces, høst og efterfølgende antistof titer analyse er beskrevet.
Automatiseret mikroskala bioreaktorer (15 mL) kan være et nyttigt redskab for celle kultur ingeniører. De lette samtidige gennemførelsen af en lang række eksperimentelle betingelser samtidig minimere potentielle proces variabilitet. Anvendelser af denne tilgang omfatter: klone screening, temperatur og pH forskydninger, medier og supplement optimering. Desuden er lille reaktor diskenheder befordrende for store Design af eksperimenter, der undersøger en række betingelser. Dette giver mulighed for opstrøms processer skal optimeres betydeligt før skala-up hvor eksperimenter er mere begrænset i omfang på grund af tid og økonomiske begrænsninger. Automatiseret mikroskala bioreaktor systemer tilbyder forskellige fordele i forhold til traditionelle små celle kultur enheder, såsom ryste kolber eller spinner kolber. Under pilotstørrelse skal proces udvikling betydelige pleje tages til at sikre, at disse fordele er realiseret. Når kører med omhu, systemet kan aktivere højt niveau automation, kan programmeres til at køre DOES med et højere antal variabler og kan reducere prøvetagningstid når de integreres med et næringsstof analyzer eller celle counter. Integration af ekspert-afledte heuristik præsenteres her, med aktuelle automatiseret mikroskala bioreaktor eksperimenter kan minimere fælles faldgruber, der hindrer meningsfulde resultater. I ekstremt, kan undladelse af at overholde de principper, der er lagt ud her føre til udstyr skader som kræver dyre reparationer. Derudover har microbioreactor systemer lille kultur diskenheder vanskeliggør karakterisering af celle kultur betingelser. Antallet og mængden af prøver taget i processen i batch mode kultur begrænses som drift diskenheder ikke kan falde til under 10 mL. Denne metode vil diskutere fordele og ulemper ved individuel bioreaktor systemer.
Monoklonale antistoffer (papagøjesyge) blev første gang produceret i mus hybridom celler i 19751. Siden da er sket en stigning i udvikling af rekombinante protein produktion at menneskeliggøre mAbs stigning i vivo sikkerhed og effektivitet2,3,4. De fleste af rekombinante protein produktionsprocesser ansætte kinesisk Hamster ovarie (CHO) celler for den lethed, hvormed de kan tilpasses til serum frie medier, deres evne til at producere proteiner med lignende posttranslationelle modifikationer som en medfødt menneskelig protein og deres pålidelighed som vært celler5,6.
Efterspørgslen er stigende til at levere produktet hurtigere, og for større patientgrupper med ensartet kvalitet. Ud over de økonomiske fordele, er repertoire af sygdomme behandles af mAbs stigende, som nu omfatter autoimmune sygdomme, efter transplantation komplikationer, gigt og kræft7. Gennemsnitlige udbytter for moderne kommercielle mAb produktionslinjer er typisk i intervallet 5-6 g/l og fortsætte med at stige5. Dette er dels opnået gennem CHO celle engineering og forbedret produktionslinje screening ved hjælp af høj overførselshastighed bioreaktorer8. Dog har de fleste stigninger i protein produktion blevet tilskrevet for at behandle forbedringer, herunder fremskridt i media optimering, celle kultur betingelser, og forbedret fodring strategier7,9,10. Næringsstof tilskud er afgørende ikke kun for ordentlig cellevækst men også for effektiv produktion af høj kvalitet protein. Derudover kræver celler støkiometriske tilsætning af specifikke næringsstoffer, som kræver yderligere forståelse for fodring strategi optimering6,11. Traditionelle optimering metoder omfatter individuelle medier komponent titrering og medier blanding med blandingen designs. Men disse metoder er tidskrævende, labor intensiv, og indebærer risici i forbindelse med menneskelige fejl12,13.
Media optimering undersøgelser tidligere påberåbt sig ryste kolber og 1-2 L bioreaktorer, som kan være uoverkommeligt dyre råvarer og menneskelig kapital. Mikroplader er også blevet brugt, men disse metoder giver begrænset skalerbarhed. Dette kan desuden stadig kræve flere tidskrævende kørsler, at indfører batch til batch variationer, som forplumrer den CQA variation forårsaget af medierne sammensætning og fodring strategi14,15,16. Således er behovet for høj overførselshastighed og meget konsekvent parallelle bioreaktor systemer opstået17,18,19,20.
Med den betydelige udgift forbundet med driften af traditionelle bænkstørrelse bioreaktorer (0,5-5 L), microbioreactors tilbyder en omkostningsbesparende alternativ for vurderingen af produktionen af biologisk fremstillet narkotika. 21 bænkstørrelse rørte tank bioreaktorer er pålidelig og giver tætte data via sensorisk arrays. Feedback kontrolsystemer giver mulighed for nem tilsyn med driften. Dog gør den forsamling, kalibrering, rengøring, lønomkostninger, substrat omkostninger og sterilisation krav bænkstørrelse rørte tank bioreaktorer dyrt og arbejdskrævende at operere. Ryste kolber og mikrotiter plader fjerne nogle af omkostningerne og labor problemer forbundet med større skala bioreaktorer, men disse alternativer giver svage kontrol over forarbejdning betingelser og producere lavdensitet data, ofte kun end-point målinger. 22
Alternativt, microbioreactors udnytte en lille arbejdsgruppe volumen for at give en skala-nede tilgang til cellelinie og upstream procesudvikling. Omfanget af microbioreactor eksperimenter kan signifikant fald løbende omkostninger gennem lavere udnyttelse af magt, substrat, labor, plads og hjælpeprogrammer. 23 Microbioreactors er ligesom ryste kolber, de er nemme at håndtere på grund af deres størrelse, men de bevare fordelene ved traditionelle bænkstørrelse bioreaktorer gennem deres online feedback kontrol af pH, temperatur, opløst ilt og syre/base forbrug samt deres real-time data output af kvalitetsparametre herunder off gas sammensætning. Microbioreactor skala giver mulighed for høj overførselshastighed screening evne, som kan være nyttige for klon udvælgelse og proces udvikling. 24
Avanceret mikroskala bioreaktor har vist sig at være et effektivt redskab til CHO celle kultur proces karakterisering og udvikling18. Heri, en automatiseret ambr15 system, bestående af 48 microbioreactors parallelt, der har vist sig at være sammenlignelig med klassisk rørte tank reaktorer i skala op undersøgelser,25 blev brugt på en måde, der svarer til forudgående arbejde, at optimeret medierne sammensætning til en CHO-DG44 cellelinje producerer en model kimære IgG16. Virkningerne af varierende media betingelser på vækst og titer blev sammenlignet, og analyseret. I dette papir er blevet præsenteret en generel retningslinje at køre i microbioreactor system og analyse af rå medier prøver.
Kører automatiseret mikro bioreaktor systemet ordentligt og omfatter effektivt rettidig gennemførelse af flere automatiserede trin. En af de vigtigste dele af kører systemet programmeringssoftware. Hvis der er nogen fejl under skrivning af programmet, vil der være alvorlige fejl i det eksperiment, der kan medføre uventede ændringer i den proces, fodring strategi, prøvetagningsmetode eller endelige produktkvalitet, som kan medføre, at resultaterne af undersøgelsen. Et andet vigtigt aspekt af kører systemet er at placere og stramme klemme plade korrekt for at sikre ordentlig kontrol. Den mest almindelige betegnelse at klemme plade har strammet ujævnt er uventet variationer i målinger for fartøjer på 1, 6, 7 og 12 (hjørne reaktortanke). Samlede angiver ustabilitet en lempelse af pakninger på fjorden gasledninger i klemme plader. Dette scenario kan hindre, at nå sætpunkt. En anden fælles faldgrube at undgå, når du starter et eksperiment er at lade cellerne sidder for længe under trinnet podning, forårsager dem til at slå sig ned. Jo mindre tid cellerne bruger mødet, skader jo mindre chance er at gradvist lavere inokulum celletal er tilføjet kronologisk reaktoren fartøjer, som kan fremkalde betydelige bias, uforvarende undersøgelsens resultater. Det er bedre at podes i flere faser, podes dvs hver kultur station efter hinanden med pause trin i mellem så cellerne ikke sidder i podning plade i mere end 15 minutter.
Vedrørende den daglige brug, vedligeholdelse af steriliteten er afgørende. Selv om systemet er i en biologisk sikkerhed kabinet, sterilitet ikke er sikret på grund af hyppige bevægelse ind og ud af hætten. Derfor skal alt, der går i hætten sprøjtes med 70% IPA. For det andet er det vigtigt at sikre, at minimal skumdannelse opstår under kultur; medierne kan tilstoppe gasning og udstødning linjer, fører til skader på klemme plade og endda grundlæggende komponenter nedenfor. Forebyggende anti-skum tilføjelse trin er afgørende i enhver mikro bioreaktor programdesign. I tilfælde af en “skum ud af” det ville være gavnligt at følge producenter rengøring protokol og kan forhindre permanent beskadigelse af klemme plader. Alternativt, brug af ikke-sparged fartøjer kan være gavnligt for lavere celle tætheder eller, når der køres i batchtilstand, som højere overflade til volumen-forholdet muliggør effektiv ilt selv med manglen på en sparger. Ikke-sparged fartøjer kan dog ikke være nyttigt for høj cellekulturer tæthed eller perfusion som hoved rummet er utilstrækkelig til at holde med kulturer stigende forbrug af ilt.
Der er mange fordele, som microbioreactor systemet, da det giver flere kontrollerede kulturer skal køres parallelt på en lille skala med større kontrol end ryste kolber. 17 derfor, systemet letter gennemførelsen af screening studies, gør, høje overførselshastighed klon undersøgelser og Transfektion undersøgelser. Automatiseret flydende håndtering reducerer også analytiker til analytiker variabilitet og samtidig minimere trættende og tidskrævende arbejde for uddannet personale. Mens der er flere fordele ved systemet, er der flere vigtige ulemper, der bør overvejes. Først, en kultur volumen på 15 mL væsentligt begrænser i proces prøvetagning og sidste høst materiale og flere alternative små bioreaktorer (op til 500 mL) har for nylig blevet tilgængelige. En nylig avancement til systemet er integrationen af den automatiserede mikroskala bioreaktor med BioProfile FLEX 2 analyzer fra Nova biomedicinsk, der afbøder i processen-prøvetagning spørgsmålet ved at reducere sample volumen for celle tæthed og næringsstof analyse . Fordele kan omfatte hurtig opsætning og stort set ingen rengøring førende driftsmæssige besparelser, men omkostningerne ved engangs enheder bør overvejes for lange sigt projekter, som det kan være dyrere at købe enheder end de genanvendelige konventionelle systemer.
Metoden drøftet i dette papir er primært egnet til batch mode cellekultur, men kan ændres alt efter behov af brugeren. Hver kultur station har uafhængig kontrol af temperatur, mens og pH kan varieres på niveau med individuelle reaktortanke. Sartorius tilbyder også DoE planlægning software designet specielt til at tillade eksperimenter til at være skræddersyet til mikro bioreaktor system. Storstilet DoE undersøgelser ved hjælp af den nye DoE software leveret af fabrikanten kan hjælpe i medier og supplere optimering. Selv om ikke bruges her, microbioreactor systemet også giver mulighed for fed-batch undersøgelser. Systemet har ikke endnu blevet optimeret til perfusion cellekulturer. Der har imidlertid været begrænsede undersøgelser og forsøg at efterligne perfusion celle kultur operation i det nuværende mikro bioreaktor system. 26 denne metode kan ændres til at efterligne højdensitet perfusion kulturer af celle afregning. Ved at variere højden som pipette er indsat i reaktoren og ved at optimere bilægge tid kan medierne fjernet og genopfyldes til spejl overfloden tilstand af kultur. Der er nye produkter i denne udvikling område, der kan fungere bedre end systemet præsenteres her evt perfusion tilstand af kultur.
I Resumé, denne undersøgelse viser brugen af automatiseret mikro-bioreaktorer og tilhørende analytiske for CHO celle kultur operationer til at producere og karakterisere en model IgG1 monoklonalt antistof. Det fremhæver rollespil små micro-bioreaktorer i bioproces fremstilling og deres indvirkning på celle kultur udvikling og medier screening. Mens der er mange fordele ved at bruge en automatiseret lille skala system, for at fuldt ud for at realisere deres fordele behandle forståelse og analytiske karakterisering er bydende nødvendigt. Denne undersøgelse giver brugeren med en retningslinje for ved hjælp af en automatiseret mikroskala reaktor system, der kan være udviklet og forbedret pr. individuel forskningsbehov.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne takke Scott Lute for den analytiske støtten. Delvis interne finansiering og støtte til dette arbejde blev leveret af CDER kritisk sti Program (CA #1-13). Dette projekt blev delvist understøttet af en udnævnelse til programmet praktik/forskning deltagelse på kontoret af bioteknologiske produkter, US Food and Drug Administration, administreret af Oak Ridge Institut for videnskab og uddannelse gennem en tværinstitutionelle aftale mellem den amerikanske Department of Energy og FDA.
CHO DG44 Cell Line | Invitrogen | A1100001 | |
ambr 15 automated microbioreactor system | Sartorius | 001-2804 | automated micro bioreactor |
ambr 15 Cell Culture 24 Disposable Bioreactors – Sparged | Sartorius | 001-2B80 | |
1 mL disposable pipette tips, sterilized | Sartorius | A-0040 | |
5 mL disposable pipette tips, sterilized | Sartorius | A-0039 | |
24 Well deep well plates | Sartorius | A-0038 | |
1 Well plates | Sartorius | A-0068 | |
Vi-Cell XR cell counter | Beckman Coulter | 731050 | automated cell counter |
EX-CELL Antifoam (gamma irradiated) | Sigma-Aldrich | 59920C-1B | |
CD OptiCHO AGT Medium | Thermo Fisher Scientific | A1122205 | |
200 mM L-glutamine | Corning | 25-005-CV | |
100X Penicillin/Streptomycin | Corning | 30-001-CI | |
125 mL F-Bottom Shake Flasks (Sterile, Vented) | Fisher Scientific | PBV12-5 | |
125 mL glass Spinner Flasks | Corning Life Sciences Glass | 4500-125 | |
250 mL PP Conical Centrifuge Tubes (Sterile) | Nalgene (Thermo Scientific) | 376814 | |
TC20 Automated Cell Counter | BioRad Laboratories, Inc. | 1450103 | |
Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 | |
10x PBS | Corning | 46-013-CM | |
BioProfile FLEX Analyzer | Nova Biomedical | 49418 | Nutrient Analyzer |
Octet Red 96 | Pall FortéBio | 99-0042 | Protein A Biosensor |
Protein A Dip and Read Biosensors | Pall FortéBio | 18-5010 | |
Polypropylene 96-well Microplate, F-bottom, Chimney-style, Black | Greiner Bio-One | 655209 |