Sanntid i Vivo sporing av Thymocytes i fremre kammer av øyet ved bruk av Laser mikroskopi
Summary
Målet med protokollen er å vise langsgående intravital sanntidssporing av thymocytes ved bruk av laser mikroskopi thymic implantater i fremre kammer av musen øyet. Gjennomsiktigheten av hornhinnen og endometrial blodkar av graftet tillater kontinuerlig opptak stamfar celle rekruttering og modne T-celle egress.
Abstract
Formålet med metoden som presenteres er å vise for første gang, transplantasjon av nyfødte thymi i fremre øye kammeret av isogenic voksen mus i vivo langsgående sanntids overvåking av thymocytes´ dynamikken i en Stangeriaceae Brisselen segmentet. Etter transplantasjon lar laserskanning mikroskopi (LSM) gjennom hornhinnen i vivo noninvasive gjentatte bildebehandling på mobilnettet oppløsning nivå. Viktigere, legger tilnærming til forrige intravital T-celle modning imaging modeller mulighet for kontinuerlig stamfar celle rekruttering og modne T-celle egress opptak i samme dyret. Ytterligere fordeler av systemet er gjennomsiktigheten av podet området, tillater makroskopisk rask overvåking av implantert vev, og tilgjengeligheten til implantatet tillater lokalisert i tillegg til systemisk behandlinger. Hovedbegrensningen er volumet av vev som passer i det nedsatte mellomrom av øyet kammer som krever for lobe trimmer. Orgel integritet er maksimert av dissecting thymus lobes i mønstre tidligere vist seg å være funksjonell for modne T-celle produksjon. Teknikken er muligheter egnet til å lage en kunstnerkoloni medisinsk relevante spørsmål knyttet til thymus funksjon som inkluderer autoimmunitet, immunsvikt og sentrale toleranse; prosesser som er mechanistically dårlig definert. Den fine Disseksjon av mekanismer guiding thymocyte overføring, differensiering og utvalg bør føre til romanen strategier målretting utvikle T-celler.
Introduction
Intrathymic T-celle differensiering og T-celle subpopulasjon utvalg utgjør nøkkelprosesser for utvikling og vedlikehold av celle-mediert immunitet i virveldyr1. Denne prosessen innebærer en omfattende rekke tett organiserte arrangementer inkludert rekruttering av progenitors fra blodet, celle spredning og migrasjon, differensial uttrykk for membran proteiner og massiv programmert celledød for delsett utvalg. Resultatet er utgivelsen av modne T-celler reaktiv til et stort spekter av utenlandske antigener mens minimerte Svar å selv-peptider som ender opp kolonisere perifere lymfoide organer av enkelte2,3. Avvikende thymocyte utvalg av αβTCR repertoaret fører til autoimmune sykdommer eller immun ubalanse4 som hovedsakelig avledet defekter i prosessene av negative eller positive forløper utvalg, henholdsvis.
Retningsbestemt overføring av thymocytes over thymus er sentral i alle faser av T-celle modning og det er tenkt som en rekke simultan eller sekvensiell flere stimuli, inkludert chemokines, lim, og de selvklebende ekstracellulær matrix (EFM) protein interaksjoner3,5. Studiet av fast vev har gjort kritisk informasjon om mønstre av uttrykk for thymocyte trekkfugler bunker i definerte thymic microenvironments5,6, mens ex vivo studier har avdekket to utbredt vandrende atferd av thymocytes i to histologisk forskjellige områder av orgelet: slow Stokastisk bevegelser i cortex og rask, trange motilitet i medulla7,8,9,10 , 11 , 12 , 13. økt vandrende priser korrelerer med thymic positive utvalg13 og negative utvalg er forbundet med virkemåte for kravlesøk støtter hypotesen at the kinetics av turen gjennom thymus avgjør riktig modning av thymocytes. Til tross for deres relevans fortsatt topologien for thymocyte-stromal cell interaksjoner og dynamikken i thymocyte motilitet over organ microenvironments under T-celle modning dårlig definerte.
De fleste ex vivo studier utført hittil inkluderer fosterets eller Kumuler på nytt thymic orgel kulturer14,15, vev skiver eller intakt thymic lobe explants der thymocyte bevegelser er visualisert ved to-fotonet laserskanning mikroskopi (TPLSM)8, en intravital tenkelig teknikk med begrenset maksimalt arbeidsavstand og tenkelig dybdeskarphet 1 mm i samsvar med vevet undersøkt16. I motsetning til de arbeidskrevende thymic orgel kulturene avhengig utvidet inkubasjon ganger skjemaet 3D-strukturer, både thymic stykke teknikken og intakt thymic lobe tilnærming tillatelse kontrollert innføring av bestemt delsett av pre merket thymocytes i en innfødt vev arkitektur miljø. Men siden blodstrøm er fraværende i disse modellene, de er tydelig begrenset for å studere rekrutteringsprosessen av thymus settling progenitors (TSPs) thymus parenchyma eller dynamikken i thymic egression av modne T-celler.
I vivo modeller for studier av thymic T-celle modning fysiologi i mus inkluderer graftene fragmenter eller hele orgel lobes plassert enten i nyre kapsel17 eller intradermally18. Selv om disse alternativene viste deres nytte å forhøre systemisk funksjonelle engraftment av vev, begrenser plasseringen av thymic grafts dypt inne dyr eller dekket av lag med ugjennomsiktig vev bruken for i vivo undersøkelse av implantater av TPLSM.
Det fremre kammeret av øyet gir en lett tilgjengelig plass for direkte overvåking av alle podet vev i kraft av gjennomsiktigheten av hornhinnen lag. Fordel er bunnen av kammeret dannet av iris rikt på blod fartøy og autonome nerveender, muliggjør rask revaskularisering og reinnervation av grafts19,20. Dr. Caicedo har brukt dette anatomiske området for vedlikehold og langtidsstudie av bukspyttkjertelen holmer i siste21. Her viser vi at denne strategien ikke bare utgjør en gyldig tilnærming for å studere thymocytes’ dynamikken i den opprinnelige orgel strukturen, men også unikt tillater for å forlenge den i vivo langsgående opptak til studiet av stamfar rekruttering og modne T-celle egression trinn i mus.
Protocol
Representative Results
Discussion
Betydningen av T-celle modning prosessen for individuelle immun kompetanse4 og antatte virkningen av forløperen celle dynamikken på modne T-celler produsert av thymus2,3, har omfattende arbeid blitt investert å utvikle alternativer til den klassiske faste vev øyeblikksbilde tilnærmingen.
Selv om vev skiver og andre explants er bedre enn inne reproduserbar vev arkitektur enn monolayers eller samlet thymic or…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet ved NIH tilskudd R56DK084321 (AC), R01DK084321 (AC), R01DK111538 (AC), R01DK113093 (AC) og R21ES025673 (AC), og den beste/2015/043 grant (Consellería de Educació, cultura jeg esport, Generalitat valenciana, Valencia, Spania) (EO). Forfatterne takker de sendt ved Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir, Valencia, Spania og Alberto Hernandez på Centro de Investigación Príncipe Felipe, Valencia, Spania for deres hjelp med filming og redigering.
Materials
| Isofluorane vaporizer w/isofluorane | Kent Scientific Corp | VetFlo-1215 | |
| Dissecting scope w/light source | Zeiss | Stemi 305 | |
| Fine dissection forceps | WPI | 500455 | |
| Medium dissection forceps | WPI | 501252 | |
| Curved tip fine dissection forceps | WPI | 15917 | |
| Vannas scissors | WPI | 503371 | |
| Dissecting scissors | WPI | 503243 | |
| Scalpel | WPI | 500353 | |
| 40 mm 18G needles | BD | 304622 | |
| Disposable transfer pipette | Thermofisher | 201C | |
| Heat pad and heat lamp | Kent Scientific Corp | Infrarred | |
| Ethanol 70% | VWR | 83,813,360 | |
| 60 mm sterile dish | SIGMA | CLS430166 | |
| Sterile 1x PBS pH(7,4) | Thermofisher | 10010023 | |
| Sterile wipes | Kimberly-Clark | LD004 | |
| Drugs for pain management | Sigma-Aldrich | A3035-1VL | |
| Saline solution or Viscotears | Novartis | N/A | |
| Stereomicroscope | Leica | MZ FLIII | |
| Head-holding adapter | Narishige | SG-4N-S | |
| Gas mask | Narishige | GM-4_S | |
| Confocal microscope | Leica | TCS SP5 II | |
| Laminar flow hood | Telstar | BIO IIA |
References
- Boehm, T., Hess, I., Swann, J. B. Evolution of lymphoid tissues. Trends in Immunology. 33, 315-321 (2012).
- Takahama, Y. Journey through the thymus: stromal guides for T-cell development and selection. Nature Reviews Immunology. 6 (2), 127-135 (2006).
- Dzhagalov, I., Phee, H. How to find your way through the thymus: a practical guide for aspiring T cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 69 (5), 663-682 (2012).
- James, K. D., Jenkinson, W. E. &. a. m. p. ;., Anderson, G. T-cell egress from the thymus: Should I stay or should I go?. Journal of Leukocyte Biology. , (2018).
- Savino, W., Mendes-Da-Cruz, D. A., Smaniotto, S., Silva-Monteiro, E., Villa-Verde, D. M. Molecular mechanisms governing thymocyte migration: combined role of chemokines and extracellular matrix. Journal of Leukocyte Biology. 75 (6), 951-961 (2004).
- Petrie, H. T., Zúñiga-Pflücker, J. C. Zoned out: functional mapping of stromal signaling microenvironments in the thymus. Annual Review of Immunology. 25, 649-679 (2007).
- Bousso, P., Bhakta, N. R., Lewis, R. S., Robey, E. Dynamics of thymocyte-stromal cell interactions visualized by two-photon microscopy. Science. 296, 1876-1880 (2002).
- Ladi, E., Herzmark, P., Robey, E. In situ imaging of the mouse thymus using 2-photon microscopy. Journal of Visualized Experiments. (11), e652 (2008).
- Bhakta, N. R., Oh, D. Y., Lewis, R. S. Calcium oscillations regulate thymocyte motility during positive selection in the three-dimensional thymic environment. Nature Immunology. 6, 143-151 (2005).
- Ehrlich, L. I., Oh, D. Y., Weissman, I. L., Lewis, R. S. Differential contribution of chemotaxis and substrate restriction to segregation of immature and mature thymocytes. Immunity. 31, 986-998 (2009).
- Le Borgne, M., Ladi, E., Dzhagalov, I., Herzmark, P., Liao, Y. F., Chakraborty, A. K., et al. The impact of negative selection on thymocyte migration in the medulla. Nature Immunology. 10, 823-830 (2009).
- Sanos, S. L., Nowak, J., Fallet, M., Bajenoff, M. Stromal cell networks regulate thymocyte migration and dendritic cell behavior in the thymus. Journal of Immunology. 186, 2835-2841 (2011).
- Witt, C. M., Raychaudhuri, S., Schaefer, B., Chakraborty, A. K., Robey, E. A. Directed migration of positively selected thymocytes visualized in real time. PLoS Biology. 3 (6), e160 (2005).
- Ramsdell, F., Zúñiga-Pflücker, J. C., Takahama, Y. In vitro systems for the study of T cell development: fetal thymus organ culture and OP9-DL1 cell coculture. Current Protocols in Immunology. , (2006).
- White, A., Jenkinson, E., Anderson, G. Reaggregate thymus cultures. Journal of Visualized Experiments. (18), e905 (2008).
- Dunn, K. W., Sutton, T. A. Functional studies in living animals using multiphoton microscopy. ILAR Journal. 49, 66-77 (2008).
- Caetano, S. S., Teixeira, T., Tadokoro, C. E. Intravital imaging of the mouse thymus using 2-photon Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (59), e3504 (2012).
- Li, J., Iwanami, N., Hoa, V. Q., Furutani-Seiki, M., Takahama, Y. Noninvasive intravital imaging of thymocyte dynamics in medaka. Journal of Immunology. 179 (3), 1605-1615 (2007).
- Adeghate, E. Host-graft circulation and vascular morphology in pancreatic tissue transplants in rats. Anatomical Record. 251, 448-459 (1998).
- Adeghate, E. Pancreatic tissue grafts are reinnervated by neuro-peptidergic and cholinergic nerves within five days of transplantation. Transplant Immunology. 10 (1), 73-80 (2002).
- Speier, S., Nyqvist, D., Köhler, M., Caicedo, A., Leibiger, I. B., Berggren, P. O. Noninvasive high-resolution in vivo imaging of cell biology in the anterior chamber of the mouse eye. Nature Protocols. 3 (8), 1278-1286 (2008).
- Speier, S., et al. Noninvasive in vivo imaging of pancreatic islet cell biology. Nature Medicine. 14 (5), 574-578 (2008).
- Morillon, Y. M., Manzoor, F., Wang, B., Tisch, R. Isolation and transplantation of different aged murine thymic grafts. Journal of Visualized Experiments. 99 (99), (2015).
- Liu, L. L., Du, X. M., Wang, Z., Wu, B. J., Jin, M., Xin, B., et al. A simplified intrathymic injection technique for mice. Biotechnic & Histochemestry. 87 (2), 140-147 (2012).
- Manna, S., Bhandoola, A. Intrathymic Injection. Methods in Molecular Biology. 1323, 203-209 (2016).
- Abdulreda, M. H., et al. High-resolution, noninvasive longitudinal live imaging of immune responses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (31), 12863-12868 (2011).
