利用 Cas9 Ribonucleoproteins 生成人 NK 细胞的研究
Summary
在这里, 我们提出了一个协议, 基因改造主要或扩大人类自然杀手 (NK) 细胞使用Cas9 Ribonucleoproteins (Cas9/RNPs)。通过使用该协议, 我们生成的人 NK 细胞缺乏转化生长 factor–b 受体 2 (TGFBR2) 和嘌呤 phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1)。
Abstract
CRISPR/Cas9 技术正在加速许多细胞类型的基因组工程, 但到目前为止, 基因传递和稳定的基因修饰在原 NK 细胞中具有挑战性。例如, 使用慢病毒载体或逆转录病毒转导的转基因分娩导致转基因 nk 细胞的产量有限, 这是由于大量程序相关的 nk 细胞凋亡所致。我们这里描述了一个无 DNA 的方法, 基因组编辑的人原发性和扩大 NK 细胞使用 Cas9 ribonucleoprotein 配合物 (Cas9/RNPs)。这种方法可以有效地剔除 NK 细胞中的 TGFBR2和HPRT1 基因。rt-pcr 数据显示, 基因表达水平显著下降, 一个代表性细胞产品的细胞毒性试验表明, RNP 修饰 NK 细胞对 TGFβ的敏感性较低。经辐照 mbIL21-expressing 馈线细胞刺激后, 基因修饰细胞可扩大电穿孔。
Introduction
癌症免疫治疗近年来取得了进展。基因修饰的嵌合体抗原受体 (车载) T 细胞是成功地应用于癌症免疫治疗的工程免疫细胞的一个很好的例子。这些细胞最近被 FDA 批准用于治疗 CD19 + B 细胞恶性肿瘤, 但迄今为止成功仅限于携带少量多弹头抗原的疾病, 而针对这种有限的抗原曲目容易发生免疫逃逸的失败。此外, 由于异基因 t 细胞引起的移植物抗宿主病的风险, 汽车 t 细胞一直关注自体 t 细胞的使用。相反, NK 细胞能够以抗原无关的方式杀死肿瘤靶点, 不会引起 GvHD, 这使他们成为癌症免疫治疗6、7、8、9的好候选者。
CRISPR/Cas9 技术最近在工程免疫细胞中得到了应用, 但用质粒对 NK 细胞进行基因重组一直是很有挑战性的。这是由于在 DNA 依赖的情况下, 转基因分娩的困难, 如慢病毒载体和逆转录病毒转导导致大量程序相关的 nk 细胞凋亡和有限的基因工程 nk 细胞的生产4,9。
许多先天免疫细胞表达了与病原体相关的分子模式的高水平的受体, 如维甲酸诱导基因 i (钻机 i), 这使更多的识别外国 DNA。在使用基于 DNA 的基因修饰方法10时, 抑制这些通路使 NK 细胞的转导效率提高。
本文介绍了利用 Cas9 ribonucleoprotein 配合物 (Cas9/RNPs) 对原发性和扩张的人 NK 细胞进行无 DNA 基因组编辑的方法。Cas9/RNPs 由三组分组成, 重组 Cas9 蛋白与合成的单导 RNA 组成的复合 crRNA 和 tracerRNA。这些 Cas9/RNPs 能够分裂基因组目标, 与国外 DNA 依赖的方法相比, 由于其作为功能性复合物的交付。此外, 快速清除细胞中的 Cas9/RNPs 可减少诱导凋亡等非靶向效应。因此, 它们可以用来产生敲出, 或与 DNA 结合, 以同源重组6,7。结果表明, Cas9/RNPs 电穿孔是克服 NK 细胞遗传修饰的早期约束的一种简便、相对有效的方法。
TGFβ是抑制 NK 细胞活化和功能的主要免疫抑制因子。有人建议, 靶向 TGFβ通路可以增加免疫细胞功能。我们针对的区域编码 TGBR2 胞外区绑定 TGFβ11.结果表明, 该基因 mRNA 表达水平显著下降, 进一步证明改良后的 NK 细胞对 TGFβ有抵抗力。此外, 改良后的细胞保持生存能力和增殖潜能, 因为它们能够在电穿孔后使用辐照的馈线细胞扩大.因此, 下面的方法是一个有希望的方法, 基因操作 NK 细胞为任何进一步的临床或研究目的。
Protocol
Representative Results
Discussion
对 NK 细胞的 DNA 依赖性修饰已经挑战了4,9。因此, 我们直接介绍了一个综合预制 ribonucleoprotein (RNPs) 复合体和 Cas9 蛋白作为纯化蛋白成初级和扩大 NK 细胞8。这种方法使我们能够消除由 RNA 聚合酶 II 开始的封盖、尾矿和其他转录和平移过程, 这可能会导致 NK 细胞凋亡与 DNA 相关的转导方法有关。
此外, 这里报告的方?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢布赖恩. 西塞罗在编辑手稿方面的帮助。
Materials
| RosetteSep™ Human NK Cell Enrichment Cocktail | STEMCELL Technologies | 15065 | The RosetteSep™ Human NK Cell Enrichment Cocktail is designed to isolate NK cells from whole blood by negative selection. |
| Ficoll-Paque® PLUS | GE Healthcare – Life Sciences | 17-1440-02 | |
| Alt-R® CRISPR-Cas9 tracrRNA | Integrated DNA Technologies | 1072532 | TracrRNA that contains proprietary chemical modifications conferring increased nuclease resistance. Hybridizes to crRNA to activate the Cas9 enzyme |
| Alt-R® CRISPR-Cas9 crRNA | Integrated DNA Technologies | Synthetically produced as Alt-R® CRISPR-Cas9 crRNA, based on the sequence of designed gRNA targeting the gene of intrest | |
| Alt-R® Genome Editing Detection Kit | Integrated DNA Technologies | 1075931 | Each kit contains T7EI endonuclease, T7EI reaction buffer, and T7EI assay controls. |
| Platinum® Taq DNA Polymerase High Fidelity | Invitrogen | 11304-011 | |
| 4D-Nucleofector™ System | Lonza | AAF-1002B | |
| Human recombinant IL-2 Protein | Novartis | 65483-0116-07 | |
| P3 Primary Cell 4D-Nucleofector™ X Kit | Lonza | V4XP-3032 | Contains pmaxGFP™ Vector, Nucleofector™ Solution, Supplement, 16-well Nucleocuvette™ Strips |
| Non-targeting: Custom siRNA, Standard 0.05 2mol ON-TARGETplus | Dharmacon | CTM-360019 | |
| Alt-R® S.p. Cas9 Nuclease 3NLS | Integrated DNA Technologies | 1074181 | Cas9 Nuclease |
| DNeasy® Blood & Tissue Handbook | Qiagen | 69504 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Calcein AM | ThermoFisher | C3099 | |
| TGFβ | Biolegend | 580706 | |
| Alt-R® CRISPR-Cas9 Control Kit, Human | Integrated DNA Technologies | 1072554 | Includes tracrRNA, HPRT positive control crRNA, negative control crRNA#1, HPRT Primer Mix, and Nuclease-Free Duplex Buffer. |
| IDTE pH 7.5 (1X TE Solution) | Integrated DNA Technologies | 11-01-02-02 | |
| Alt-R® Cas9 Electroporation Enhancer | Integrated DNA Technologies | 1075915 | Cas9 Electroporation Enhancer |
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