דור של תאים מעלף העיקרי ומורחבת NK האנושי באמצעות Cas9 Ribonucleoproteins
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול שינוי גנטי ראשי או מורחב האנושי הטבעיים (NK) תאים הרוצח באמצעות Cas9 Ribonucleoproteins (Cas9/RNPs). באמצעות פרוטוקול זה, אנו להפיק תאי NK אדם חסר צורה של קולטן גורם גדילה – b 2 (TGFBR2), hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1).
Abstract
CRISPR/Cas9 טכנולוגיה מאיצה בהנדסת הגנום הרבה סוגי תאים, אך עד כה, המסירה הגן, שינוי יציב ג’ין היה מאתגר בתאי NK העיקרי. לדוגמה, transgene משלוח באמצעות התמרה חושית lentiviral או retroviral הביא תשואה מוגבלת של תאי NK מהונדס עקב ניכר אפופטוזיס התא NK הקשורים בהליך. נתאר כאן שיטה ללא ה-DNA הגנום העריכה הראשית ומורחבת NK תאים אנושיים באמצעות קומפלקסים ribonucleoprotein Cas9 (Cas9/RNPs). שיטה זו אפשרה נוקאאוט יעיל של TGFBR2 , HPRT1 הגנים בתאי NK. RT-PCR הנתונים הראו ירידה משמעותית ברמת ביטוי גנים, והציע וזמינותו cytotoxicity של מוצר תא נציג כי תאי NK RNP-לאחרונה הפך פחות רגישים TGFβ. תאים מהונדסים יכול להיות פוסט-אלקטרופורציה המורחב על ידי גירוי עם mbIL21-ביטוי לקרינה מזין תאים.
Introduction
חיסוני סרטן כבר מתקדמים בשנים האחרונות. תאי T מהונדס גנטית chimeric אנטיגן קולטן (מכונית) הם דוגמה מצוינת של תאים חיסוניים מהונדסים בהצלחה פרוסים חיסוני סרטן. תאים אלה אושרו לאחרונה על-ידי ה-FDA לטיפול נגד CD19 + B תא ממאירות, אבל ההצלחה עד כה הוגבלה למחלות הנושאת מספר אנטיגנים targetable, פילוח כזה repertoires antigenic מוגבלת היא מועדת לכישלון על ידי המערכת החיסונית לברוח. יתר על כן, תאי T המכונית כבר התמקדו השימוש בתאי T עצמיים בשל הסיכון של שתל – מול – מארח מחלות הנגרמת על ידי תאי T allogeneic. לעומת זאת, תאי NK מסוגלים להרוג את הגידול מטרות באופן בלתי תלוי-אנטיגן, ולעולם לא לגרום GvHD, מה שהופך אותם. מועמד טוב סרטן חיסוני6,7,8,9.
CRISPR/Cas9 הטכנולוגיה כבר בשימוש לאחרונה הנדסת תאים חיסוניים, אך מבחינה גנטית התכנות תאי NK עם פלסמידים תמיד היה מאתגר. זה היה עקב קשיים בלידה transgene DNA באופן תלויים כגון lentiviral ו retroviral התמרה חושית גורם משמעותי אפופטוזיס התא NK הקשורים בהליך ייצור מוגבל של תאי NK מהונדס גנטית4 , 9.
הרבה תאים חיסוניים מולדת אקספרס רמות גבוהות של קולטני לחידושים מולקולרית פתוגן-הקשורים כגון Retinoic חומצה-inducible ג’ין אני (מעטה-אני), אשר מאפשרים זיהוי מוגברת של דנ א זר. דיכוי של המסלולים הללו אפשרה יעילות גבוהה יותר התמרה חושית בתאי NK בעת שימוש בשיטות מבוסס DNA ההנדסה הגנטית10.
נתאר כאן את שיטת לשימוש ללא ה-DNA הגנום עריכה של ראשי ומורחבת תאי NK אדם ניצול קומפלקסים ribonucleoprotein Cas9 (Cas9/RNPs). Cas9/RNPs מורכב של שלושת הרכיבים, ומורכבת עם סינתטי RNA חד-מדריך מורכבת, ומורכבת crRNA ו tracerRNA Cas9 חלבון רקומביננטי. Cas9/RNPs האלה מסוגלים ביקוע מטרות גנומית עם יעילות גבוהה יותר לעומת גישות תלויי-דנ א זר בשל משלוח שלהם כמו מתחמי פונקציונלי. בנוסף, אישור מהיר של Cas9/RNPs את התאים עשויה להפחית את ההשפעות חופש-יעד כגון אינדוקציה של אפופטוזיס. לפיכך, הם יכולים לשמש כדי לייצר טוק-outs, או לדפוק על הדלת-in בשילוב עם ה-DNA רקומבינציה הומולוגית6,7. הראנו את אלקטרופורציה של Cas9/RNPs היא שיטה נוחה ויעילה יחסית מתגבר על האילוצים הקודמים של ההנדסה הגנטית בתאי NK.
TGFβ הוא ציטוקין לדיכוי המערכת החיסונית הגדולות, אשר מעכב את ההפעלה והפונקציות של תאי NK. הוצע כי המיקוד מסלול TGFβ יכול להגביר את תאי מערכת החיסון. שסימנו את האזור קידוד ectodomain TGBR2 אשר נקשר TGFβ11. התוצאות נציג להראות ירידה משמעותית ברמת mRNA הביטוי של גן זה, בהמשך מדגימים כי תאי NK ששונה להיות עמידים בפני TGFβ. בנוסף, התאים שהשתנו לשמר הכדאיות ואת הפוטנציאל המקדימות, כפי שהם יכולים להיות מורחב פוסט-אלקטרופורציה באמצעות מזין לקרינה תאי. לכן, השיטה הבאה היא גישה מבטיחה לתמרן גנטית של תאי NK עבור כל עוד יותר קליני או למטרות מחקר.
Protocol
Representative Results
Discussion
השינוי תלוי-DNA של תאי NK מאתגרת4,9. לכן, הצגנו ישירות על מתחם לאכסון preformed ribonucleoprotein (RNPs), Cas9 חלבון כמו חלבון מטוהרים לתוך ראשי ומורחבת NK תאים8. שיטה זו אפשרה לנו לחסל את מיצוי, עוקב, ועל תהליכים אחרים גנים ברמת השעתוק והתרגום נכתבו על ידי RNA פולימראז II,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו להכיר טוליוס בריאן על עזרתו די בעריכת כתב היד.
Materials
| RosetteSep™ Human NK Cell Enrichment Cocktail | STEMCELL Technologies | 15065 | The RosetteSep™ Human NK Cell Enrichment Cocktail is designed to isolate NK cells from whole blood by negative selection. |
| Ficoll-Paque® PLUS | GE Healthcare – Life Sciences | 17-1440-02 | |
| Alt-R® CRISPR-Cas9 tracrRNA | Integrated DNA Technologies | 1072532 | TracrRNA that contains proprietary chemical modifications conferring increased nuclease resistance. Hybridizes to crRNA to activate the Cas9 enzyme |
| Alt-R® CRISPR-Cas9 crRNA | Integrated DNA Technologies | Synthetically produced as Alt-R® CRISPR-Cas9 crRNA, based on the sequence of designed gRNA targeting the gene of intrest | |
| Alt-R® Genome Editing Detection Kit | Integrated DNA Technologies | 1075931 | Each kit contains T7EI endonuclease, T7EI reaction buffer, and T7EI assay controls. |
| Platinum® Taq DNA Polymerase High Fidelity | Invitrogen | 11304-011 | |
| 4D-Nucleofector™ System | Lonza | AAF-1002B | |
| Human recombinant IL-2 Protein | Novartis | 65483-0116-07 | |
| P3 Primary Cell 4D-Nucleofector™ X Kit | Lonza | V4XP-3032 | Contains pmaxGFP™ Vector, Nucleofector™ Solution, Supplement, 16-well Nucleocuvette™ Strips |
| Non-targeting: Custom siRNA, Standard 0.05 2mol ON-TARGETplus | Dharmacon | CTM-360019 | |
| Alt-R® S.p. Cas9 Nuclease 3NLS | Integrated DNA Technologies | 1074181 | Cas9 Nuclease |
| DNeasy® Blood & Tissue Handbook | Qiagen | 69504 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Calcein AM | ThermoFisher | C3099 | |
| TGFβ | Biolegend | 580706 | |
| Alt-R® CRISPR-Cas9 Control Kit, Human | Integrated DNA Technologies | 1072554 | Includes tracrRNA, HPRT positive control crRNA, negative control crRNA#1, HPRT Primer Mix, and Nuclease-Free Duplex Buffer. |
| IDTE pH 7.5 (1X TE Solution) | Integrated DNA Technologies | 11-01-02-02 | |
| Alt-R® Cas9 Electroporation Enhancer | Integrated DNA Technologies | 1075915 | Cas9 Electroporation Enhancer |
References
- Guven, H., et al. Efficient gene transfer into primary human natural killer cells by retroviral transduction. Experimental Hematology. 33 (11), 1320-1328 (2005).
- Alici, E., Sutlu, T., Sirac Dilber, M. Retroviral gene transfer into primary human natural killer cells. Methods in Molecular Biology. 508, 127-137 (2009).
- Carlsten, M., Childs, R. W. Genetic Manipulation of NK Cells for Cancer Immunotherapy: Techniques and Clinical Implications. Frontiers in Immunology. 6, 266 (2015).
- Mehta, R. S., Rezvani, K. Chimeric Antigen Receptor Expressing Natural Killer Cells for the Immunotherapy of Cancer. Frontiers in Immunology. 283, 9 (2018).
- Zuris, J. A., et al. Cationic lipid-mediated delivery of proteins enables efficient protein-based genome editing in vitro and in vivo. Nature Biotechnology. 33 (1), 73-80 (2015).
- Wang, M., et al. Efficient delivery of genome-editing proteins using bioreducible lipid nanoparticles. PNAS. 113 (11), 2868-2873 (2016).
- Liang, Z., et al. Efficient DNA-free genome editing of bread wheat using CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein complexes. Nature Communications. 8, 14261 (2017).
- DeWitt, M. A., Corn, J. E., Carroll, D. Genome editing via delivery of Cas9 ribonucleoprotein. Methods. , 9-15 (2017).
- Rezvani, K., Rouce, R., Liu, E., Shpall, E. Engineering Natural Killer Cells for Cancer Immunotherapy. Molecular Therapy. 25 (8), 1769-1781 (2017).
- Sutlu, T., et al. Inhibition of intracellular antiviral defense mechanisms augments lentiviral transduction of human natural killer cells: implications for gene therapy. Human Gene Therapy. 23 (10), 1090-1100 (2012).
- Viel, S., et al. TGF-beta inhibits the activation and functions of NK cells by repressing the mTOR pathway. Science Signaling. 9 (415), (2016).
- Somanchi, S. S., Senyukov, V. V., Denman, C. J., Lee, D. A. Expansion, purification, and functional assessment of human peripheral blood NK cells. JoVE. (48), (2011).
- Lee, D. A., Verneris, M. R., Campana, D. Acquisition, preparation, and functional assessment of human NK cells for adoptive immunotherapy. Methods in Molecular Biology. , 61-77 (2010).
- Vouillot, L., Thelie, A., Pollet, N. Comparison of T7E1 and surveyor mismatch cleavage assays to detect mutations triggered by engineered nucleases. G3. 5 (3), 407-415 (2015).
- Eyquem, J., et al. Targeting a CAR to the TRAC locus with CRISPR/Cas9 enhances tumour rejection. Nature. 543 (7643), 113-117 (2017).
- Liang, X., et al. Rapid and highly efficient mammalian cell engineering via Cas9 protein transfection. Journal of Biotechnology. 208, 44-53 (2015).
- Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).
- Chmielecki, J., et al. Genomic Profiling of a Large Set of Diverse Pediatric Cancers Identifies Known and Novel Mutations across Tumor Spectra. 암 연구학. 77 (2), 509-519 (2017).
- Schultz, L. M., Majzner, R., Davis, K. L., Mackall, C. New developments in immunotherapy for pediatric solid tumors. Current Opinion in Pediatrics. 30 (1), 30-39 (2018).
