Поколение нокаут-основной и Расширенный человеческого НК-клеток с помощью Cas9 Ribonucleoproteins
Summary
Здесь мы представляем протокол генетически изменить основной или расширенный человека природные (NK) киллеры с помощью Cas9 Ribonucleoproteins (Cas9/RNPs). Используя этот протокол, мы создали NK клеток человека недостаточно для превращения рецепторов фактора роста – b 2 (TGFBR2) и phosphoribosyltransferase гипоксантина 1 (HPRT1).
Abstract
ТРИФОСФАТЫ/Cas9 технологии ускоряется генома техники во многих типов клеток, но до настоящего времени доставки генов и стабильной гена модификации были сложным в первичной НК-клеток. К примеру трансген доставки с помощью лентивирусные или ретровирусной трансдукции привели к ограниченной доходности генетически НК-клеток за счет существенной связанные процедуры NK клеток апоптоз. Здесь мы описываем ДНК, свободной метод для изменения генома человека основной и расширенный НК-клеток с использованием Cas9 рибонуклеопротеида комплексов (Cas9/RNPs). Этот метод позволил эффективно нокаут TGFBR2 и HPRT1 генов в клетки. RT-PCR данные показали значительное снижение уровня выражения гена, и цитотоксичность пробирного представитель ячейки продукта предложил, что RNP-Изменение NK клеток стали менее чувствительными к TGFβ. Генетически модифицированные клетки может быть расширение пост электропорация путем стимуляции с облученного mbIL21-выражая клетки фидера.
Introduction
Иммунотерапия рака была выдвинута в последние годы. Генетически модифицированные химерных антигена рецепторов (автомобиль) Т-клетки являются отличным примером инженерии иммунных клеток, успешно развернуты в Рак иммунотерапия. Эти клетки были недавно одобрен FDA для лечения против CD19 + B клеток злокачественных опухолей, но успех пока ограничивается заболеваний, принимая несколько ориентации антигены и ориентации такого ограниченного антигенной репертуаров склонны к неспособности иммунных побег. Кроме того автомобиль Т-клетки были сосредоточены на использование аутологических клеток T из-за риска – трансплантат против – хост заболеваний, вызванных аллогенных клеток T. В противоположность этому НК-клетки способны убить цели опухолевого антигена независимым образом и не вызывают GvHD, что делает их хорошим кандидатом для рака иммунотерапия6,,78,9.
ТРИФОСФАТЫ/Cas9 технология была использована недавно в инженерных иммунных клеток, но генетически перепрограммирования НК-клеток с плазмид всегда была сложной. Это объясняется трудностями в доставке трансген зависимым образом ДНК как лентивирусные и антиретровирусным трансдукции, вызывая значительные связанные процедуры NK клеток апоптоз и ограниченное производство генетически NK клеток4 , 9.
Многие врожденные иммунные клетки Экспресс высокий уровень рецепторов для патоген связанные молекулярные модели, такие как ретиноевой кислоты inducible gene я (RIG-я), которые позволяют повышение признания иностранных ДНК. Подавление этих путей позволило более высокую эффективность трансдукции в НК-клеток при использовании методов на основе ДНК генетической модификации10.
Здесь мы описываем метод для использования свободных ДНК генома редактирования основного и расширенного NK клеток человека используя Cas9 рибонуклеопротеида комплексы (Cas9/RNPs). Cas9/RNPs состоит из трех компонентов, рекомбинантные Cas9 белка complexed с синтетическими сингл руководство РНК состоит из complexed crRNA и tracerRNA. Эти Cas9/RNPs способны раскалывание genomic цели с более высокой эффективностью по сравнению с иностранными ДНК зависимая подходов благодаря их доставки как функциональных комплексов. Кроме того быстрое оформление Cas9/RNPs от клеток может уменьшить пробить эффекты, такие как индукции апоптоза. Таким образом они могут использоваться для создания плей аутов, или стук ins для гомологичная рекомбинация6,7в сочетании с ДНК. Мы показали, что электропорации Cas9/RNPs-это простой и довольно эффективный метод, который преодолевает предыдущие ограничения генетической модификации в НК-клеток.
TGFβ является основных иммуносупрессивные цитокинов, который ингибирует активацию и функции НК-клеток. Было высказано предположение о том, что ориентация на тропе TGFβ может увеличить функции иммунных клеток. Мы целевой регион кодирования TGBR2 ectodomain, который связывает TGFβ11. Представитель результаты показывают значительное снижение уровня экспрессии мРНК этого гена и далее демонстрировать, что изменение НК-клетки становятся устойчивыми к TGFβ. Кроме того измененные клетки сохраняют жизнеспособность и пролиферативный потенциал, поскольку они способны быть расширенной пост электропорация облученного фидер клеток. Таким образом, следующий метод является перспективным подходом к генетически манипулировать НК-клеток для любого дальнейшего клинического или исследовательских целях.
Protocol
Representative Results
Discussion
ДНК зависимая модификация НК-клеток сложной4,9. Мы, таким образом, внедрили непосредственно комплекс синтетически преформированных рибонуклеопротеида (RNPs) и Cas9 белка как очищенный протеин в основной и расширенный NK клеток8. Этот метод позвол?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы признаем Брайан Tullius за его любезное помощь в редактировании рукопись.
Materials
| RosetteSep™ Human NK Cell Enrichment Cocktail | STEMCELL Technologies | 15065 | The RosetteSep™ Human NK Cell Enrichment Cocktail is designed to isolate NK cells from whole blood by negative selection. |
| Ficoll-Paque® PLUS | GE Healthcare – Life Sciences | 17-1440-02 | |
| Alt-R® CRISPR-Cas9 tracrRNA | Integrated DNA Technologies | 1072532 | TracrRNA that contains proprietary chemical modifications conferring increased nuclease resistance. Hybridizes to crRNA to activate the Cas9 enzyme |
| Alt-R® CRISPR-Cas9 crRNA | Integrated DNA Technologies | Synthetically produced as Alt-R® CRISPR-Cas9 crRNA, based on the sequence of designed gRNA targeting the gene of intrest | |
| Alt-R® Genome Editing Detection Kit | Integrated DNA Technologies | 1075931 | Each kit contains T7EI endonuclease, T7EI reaction buffer, and T7EI assay controls. |
| Platinum® Taq DNA Polymerase High Fidelity | Invitrogen | 11304-011 | |
| 4D-Nucleofector™ System | Lonza | AAF-1002B | |
| Human recombinant IL-2 Protein | Novartis | 65483-0116-07 | |
| P3 Primary Cell 4D-Nucleofector™ X Kit | Lonza | V4XP-3032 | Contains pmaxGFP™ Vector, Nucleofector™ Solution, Supplement, 16-well Nucleocuvette™ Strips |
| Non-targeting: Custom siRNA, Standard 0.05 2mol ON-TARGETplus | Dharmacon | CTM-360019 | |
| Alt-R® S.p. Cas9 Nuclease 3NLS | Integrated DNA Technologies | 1074181 | Cas9 Nuclease |
| DNeasy® Blood & Tissue Handbook | Qiagen | 69504 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Calcein AM | ThermoFisher | C3099 | |
| TGFβ | Biolegend | 580706 | |
| Alt-R® CRISPR-Cas9 Control Kit, Human | Integrated DNA Technologies | 1072554 | Includes tracrRNA, HPRT positive control crRNA, negative control crRNA#1, HPRT Primer Mix, and Nuclease-Free Duplex Buffer. |
| IDTE pH 7.5 (1X TE Solution) | Integrated DNA Technologies | 11-01-02-02 | |
| Alt-R® Cas9 Electroporation Enhancer | Integrated DNA Technologies | 1075915 | Cas9 Electroporation Enhancer |
References
- Guven, H., et al. Efficient gene transfer into primary human natural killer cells by retroviral transduction. Experimental Hematology. 33 (11), 1320-1328 (2005).
- Alici, E., Sutlu, T., Sirac Dilber, M. Retroviral gene transfer into primary human natural killer cells. Methods in Molecular Biology. 508, 127-137 (2009).
- Carlsten, M., Childs, R. W. Genetic Manipulation of NK Cells for Cancer Immunotherapy: Techniques and Clinical Implications. Frontiers in Immunology. 6, 266 (2015).
- Mehta, R. S., Rezvani, K. Chimeric Antigen Receptor Expressing Natural Killer Cells for the Immunotherapy of Cancer. Frontiers in Immunology. 283, 9 (2018).
- Zuris, J. A., et al. Cationic lipid-mediated delivery of proteins enables efficient protein-based genome editing in vitro and in vivo. Nature Biotechnology. 33 (1), 73-80 (2015).
- Wang, M., et al. Efficient delivery of genome-editing proteins using bioreducible lipid nanoparticles. PNAS. 113 (11), 2868-2873 (2016).
- Liang, Z., et al. Efficient DNA-free genome editing of bread wheat using CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein complexes. Nature Communications. 8, 14261 (2017).
- DeWitt, M. A., Corn, J. E., Carroll, D. Genome editing via delivery of Cas9 ribonucleoprotein. Methods. , 9-15 (2017).
- Rezvani, K., Rouce, R., Liu, E., Shpall, E. Engineering Natural Killer Cells for Cancer Immunotherapy. Molecular Therapy. 25 (8), 1769-1781 (2017).
- Sutlu, T., et al. Inhibition of intracellular antiviral defense mechanisms augments lentiviral transduction of human natural killer cells: implications for gene therapy. Human Gene Therapy. 23 (10), 1090-1100 (2012).
- Viel, S., et al. TGF-beta inhibits the activation and functions of NK cells by repressing the mTOR pathway. Science Signaling. 9 (415), (2016).
- Somanchi, S. S., Senyukov, V. V., Denman, C. J., Lee, D. A. Expansion, purification, and functional assessment of human peripheral blood NK cells. JoVE. (48), (2011).
- Lee, D. A., Verneris, M. R., Campana, D. Acquisition, preparation, and functional assessment of human NK cells for adoptive immunotherapy. Methods in Molecular Biology. , 61-77 (2010).
- Vouillot, L., Thelie, A., Pollet, N. Comparison of T7E1 and surveyor mismatch cleavage assays to detect mutations triggered by engineered nucleases. G3. 5 (3), 407-415 (2015).
- Eyquem, J., et al. Targeting a CAR to the TRAC locus with CRISPR/Cas9 enhances tumour rejection. Nature. 543 (7643), 113-117 (2017).
- Liang, X., et al. Rapid and highly efficient mammalian cell engineering via Cas9 protein transfection. Journal of Biotechnology. 208, 44-53 (2015).
- Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).
- Chmielecki, J., et al. Genomic Profiling of a Large Set of Diverse Pediatric Cancers Identifies Known and Novel Mutations across Tumor Spectra. 암 연구학. 77 (2), 509-519 (2017).
- Schultz, L. M., Majzner, R., Davis, K. L., Mackall, C. New developments in immunotherapy for pediatric solid tumors. Current Opinion in Pediatrics. 30 (1), 30-39 (2018).
