Kryds Microbiome karakterisering af næste generations 16S rRNA-amplikon sekventering
Summary
Her præsenterer vi en next-generation sequencing protokol til 16S rRNA sekvensering, som muliggør identifikation og karakterisering af mikrobielle samfund inden for vektorer. Denne metode involverer DNA udvinding, forstærkning og stregkodesystem prøver gennem PCR, sekventering på en flow-celle, og bioinformatik at matche sekvens data til fylogenetiske oplysninger.
Abstract
I de seneste årtier, har vektorbårne sygdomme genopstået og udvidet med alarmerende hast, forårsager betydelig sygelighed og dødelighed på verdensplan. Effektiv og bredt tilgængelige vacciner mangler for de fleste af disse sygdomme, nødvendiggør udvikling af nye sygdom risikobegrænsende strategier. Med henblik herpå indebærer en lovende avenue til sygdomsbekæmpelse, målretning vektor microbiome, Fællesskabet af mikrober bebo vektoren. Vektor microbiome spiller en central rolle i patogenet dynamics, og manipulationer af microbiome har ført til reducerede vektor overflod eller patogen transmission for en håndfuld af vektor-bårne sygdomme. Omsætte disse resultater til sygdom kontrol applikationer kræver imidlertid en grundig forståelse af vektor mikrobiel økologi, historisk begrænset af utilstrækkelig teknologi på dette område. Fremkomsten af næste generation sequencing tilgange har aktiveret hurtig, meget parallel sekventering af forskelligartede mikrobielle samfund. Målretning meget bevaret 16S rRNA gen har lettet beskrivelser af mikrober til stede inden for vektorer under forskellige økologiske og eksperimentelle betingelser. Denne teknik indebærer forstærkning af 16S rRNA gen, prøve stregkodesystem via PCR, lastning prøver på en flow-celle til sekvensering, og bioinformatik tilgange til at matche sekvens data med fylogenetiske oplysninger. Arten eller slægten-niveau identifikation for et stort antal af flergangsbestemmelser kan typisk opnås gennem denne tilgang, således omgå udfordringer af lav afsløring, opløsning og output fra traditionelle dyrkning, mikroskopi eller histologiske farvning teknikker. Derfor, denne metode er velegnet til kendetegner vektor mikrober forskelligartede betingelser men i øjeblikket kan ikke give oplysninger om mikrobielle funktion, placering i vektor eller reaktion på behandling med antibiotika. Samlet, 16S næste generation sequencing er en kraftfuld teknik til bedre forståelse af identitet og rolle af vektor mikrober i sygdom dynamics.
Introduction
Genopblussen og udbredelsen af vektorbårne sygdomme i de seneste årtier udgøre en alvorlig trussel mod verdenssundheden menneske og dyreliv. Effektive vacciner mangler for de fleste af disse sygdomme, og kontrolindsats er hæmmet af den komplekse biologiske natur af vektorer og vektor-værtssammenspil. Oplysninger om betydningen af mikrobielle interaktioner inden for en vektor i patogen transmission kan åbne mulighed for at udvikle nye strategier, som omgå disse udfordringer. Især kan samspillet mellem vektor-associerede mikrobielle latente, symbionter og patogener, omtales som microbiome, have vigtige konsekvenser for patogen transmission. Overvældende beviser nu støtter denne påstand med eksempler viser en sammenhæng mellem den vektor microbiome og kompetence for sygdomme som malaria, Zika virus og borreliose1,2,3. Omsætte disse resultater til strategier til sygdomsbekæmpelse kræver imidlertid en langt mere detaljeret forståelse af struktur, funktion og oprindelsen af vektor microbiomes. Identifikation og karakterisering af vektor mikrobielle samfund under forskellige økologiske og eksperimentelle betingelser udgør en vigtig vej frem i dette felt.
En procedure til at identificere de mikrobielle beboere af en patogen vektor tilbydes her ved at udnytte den vestlige sort-benede kryds, Ixodes pacificus, en vektor arter sygdomsbærer Lyme sygdom Borrelia burgdorferi. Mens flåter harbor flere typer af menneskelige patogener end nogen andre leddyr, er relativt lidt kendt om biologi og Fællesskabets økologi af kryds microbiomes4. Det er indlysende, at flåter havnen et mangfoldigt udvalg af vira, bakterier, svampe og protozoer, som omfatter latente, endosymbionts og forbigående mikrobielle beboere5,4. Forudgående arbejde har demonstreret stærk variationer i Ixodes microbiomes forbundet med geografi, arter, sex, livsstadium og blodmel kilde6,7,8. Men de mekanismer, der ligger til grund for denne variation forbliver ukendt og garanterer mere detaljerede undersøgelser af oprindelse og montering af disse mikrobielle samfund. Flåter kan erhverve mikrober gennem vertikal overførsel, kontakt med værter, og optagelsen fra miljøet gennem Spirakler, mund og anal pore9. Forstå de faktorer, udformningen af indledende dannelse og udvikling af kryds microbiome, er specielt den relative bidrag af lodrette og miljømæssige transmission, vigtigt for at forstå de naturlige mønstre og variationer i kryds Microbiome mangfoldighed og hvordan disse Fællesskaber interagerer under patogen transmission, med mulige applikationer til sygdom eller vektor kontrol.
Kraftfuld molekylære teknikker, såsom næste generation sequencing, nu eksisterer for at identificere mikrobielle samfund og kan anvendes til at karakterisere vektor microbiomes på forskellige miljømæssige eller eksperimentelle betingelser. Før fremkomsten af disse høj overførselshastighed sekventering strategier påberåbt identifikation af mikrober sig overvejende mikroskopi og kultur. Mens mikroskopi er en hurtig og nem teknik, er morfologiske metoder for at identificere mikrober i sagens natur subjektive og grove og begrænset af lav følsomhed og registrering af10. Kultur-baserede metoder anvendes bredt til mikrobiel identifikation og kan bruges til at bestemme modtagelighed af mikrober til narkotika behandlinger11. Men denne metode også lider af lav følsomhed, som det er blevet anslået, at færre end 2% af miljømæssige mikrober kan dyrkes i et laboratorium indstilling12. Histologiske farvning tilgange har også været ansat til at opdage og lokalisere specifikke mikrober inden for vektorer, aktiverer undersøgelser af forskellige taxa distributioner inden for kryds og studere hypoteser om mikrobielle interaktioner. Forudgående kendskab til mikrobiel identitet er imidlertid nødvendig for at vælge de passende pletter, hvilket gør denne strategi dårligt egnet til mikrobiel karakterisering og identifikation. Derudover histologiske farvning er en meget tidskrævende, arbejdskrævende proces og skalerer ikke godt for store stikprøvestørrelser. Traditionelle molekylære metoder såsom Sanger sekventering er ligeledes begrænset i deres følsomhed og påvisning af forskelligartede mikrobielle samfund.
Næste generation sequencing giver mulighed for hurtig identifikation af mikrober fra et stort antal prøver. Tilstedeværelsen af standard markørgener og reference databaser yderligere giver forbedret taksonomiske opløsning, ofte til niveauet slaegt eller art. Lille subunit ribosomale RNA’er bruges ofte til at nå dette mål med 16S rRNA er den mest almindelige på grund af tilstedeværelsen af bevarede og variable regioner inden for gen, giver mulighed for oprettelsen af universel primere med unikke amplikoner for hver bakteriel arter13,14. Denne rapport beskriver en procedure for at identificere taxa i kryds microbiome gennem 16S rRNA næste generation sequencing. I særdeleshed understreger denne protokol trin involveret i udarbejdelsen af prøver til sekvensering. Mere generelle oplysninger om rækkefølgen og bioinformatik trin leveres, som der er en række sekventering platforme og analyse programmer øjeblikket er til rådighed, hver med omfattende eksisterende dokumentation. Den samlede gennemførligheden af denne næste generation sequencing tilgang er påvist ved at anvende det til en undersøgelse af mikrobielle samfund forsamling inden for en vigtig sygdom vektor.
Protocol
Representative Results
Discussion
Næste generations sekventering af 16S rRNA har blive en standardmetode for mikrobiel identifikation og aktiveret studiet af hvordan vektor microbiomes påvirke patogen transmission. Protokol her skitserede detaljer brugen af denne metode til at undersøge mikrobielle samfund forsamling i I. pacificus, en vektor arter for Lyme sygdom; Det kan dog nemt anvendes til at studere andre fiskearter, kryds eller leddyr vektor.
Faktisk, 16S rRNA sekventering microbiome analyse har været brugt…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af National Science Foundation støtte til A.S. (DEB #1427772, 1745411, 1750037).
Materials
| Item | Name of Material/Equipment | Company | Catalog # |
| 1 | DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 |
| 2 | Qubit 4 Fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q3326 |
| 3 | NanoDrop 8000 Spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-8000-GL |
| 4 | 2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix | Kapa Biosystems | KK2501 |
| 5 | AMPure XP beads | Agen Court | A63880 |
| 6 | Magnetic Rack | ThermoFisher Scientific | MR02 |
| 6 | TE buffer | Teknova | T0223 |
| 7 | Nextera Index Kit | Illumina | FC-121-1011 |
| 8 | KAPA Library Quantification Kit | Roche | KK4824 |
| 9 | MiSeq System | Illumina | SY-410-1003 |
| 10 | MiSeq Reagent Kit v3 | Illumina | MS-102-3001 |
| 11 | 10 mM Tris-HCl with 0.1% Tween 20 | Teknova | T7724 |
References
- Dong, Y., Manfredini, F., Dimopoulos, G. Implication of the mosquito midgut microbiota in the defense against malaria parasites. Public Library of Science Pathogens. 5 (5), (2009).
- Aliota, M. T., Peinado, S. A., Velez, I. D., Osorio, J. E. The wMel strain of Wolbachia reduces transmission of Zika virus by Aedes aegypti. Scientific Reports. 6 (July), 1-7 (2016).
- Narasimhan, S., et al. Gut microbiota of the tick vector Ixodes scapularis modulate colonization of the Lyme disease spirochete. Cell Host and Microbe. 15 (1), 58-71 (2014).
- Clay, K., Fuqua, C. The Tick Microbiome: Diversity, Distribution and Influence of the Internal Microbial Community for a Blood-Feeding Disease Vector. Critical Needs and Gaps in Understanding Prevention, Amelioration, and Resolution of Lyme and Other Tick-Borne Diseases: The Short-Term and Long-Term Outcomes. , 1-22 (2010).
- Noda, H., Munderloh, U. G., Kurtti, T. J. Endosymbionts of Ticks and Their Relationship to Wolbachia spp. and Tick-Borne Pathogens of Humans and Animals. Applied and Environmental Microbiology. 63 (10), 3926-3932 (1997).
- van Treuren, W., et al. Variation in the microbiota of Ixodes ticks with regard to geography, species, and sex. Applied and Environmental Microbiology. 81 (18), 6200-6209 (2015).
- Swei, A., Kwan, J. Y. Tick microbiome and pathogen acquisition altered by host blood meal. The ISME Journal: Multidisciplinary Journal of Microbial Ecology. 11 (3), 813-816 (2017).
- Kwan, J. Y., Griggs, R., Chicana, B., Miller, C., Swei, A. Vertical vs. horizontal transmission of the microbiome in a key disease vector, Ixodes pacificus. Molecular Ecology. 26 (23), 6578-6589 (2017).
- Narasimhan, S., Fikrig, E. Tick microbiome: The force within. Trends in Parasitology. 31 (7), 315-323 (2015).
- Houpikian, P., Raoult, D. Traditional and molecular techniques for the study of emerging bacterial diseases: One laboratory’s perspective. Emerging Infectious Diseases. 8 (2), 122-131 (2002).
- Kotsilkov, K., Popova, C., Boyanova, L., Setchanova, L., Mitov, I. Comparison of culture method and real-time PCR for detection of putative periodontopathogenic bacteria in deep periodontal pockets. Biotechnology and Biotechnological Equipment. 29 (5), 996-1002 (2015).
- Wade, W. Unculturable bacteria – The uncharacterized organisms that cause oral infections. Journal of the Royal Society of Medicine. 95 (2), 81-83 (2002).
- Klindworth, A., et al. Evaluation of general 16S ribosomal RNA gene PCR primers for classical and next-generation sequencing-based diversity studies. Nucleic Acids Research. 41 (1), 1-11 (2013).
- Janda, J. M., Abbott, S. L. 16S rRNA gene sequencing for bacterial identification in the diagnostic laboratory: Pluses, perils, and pitfalls. Journal of Clinical Microbiology. 45 (9), 2761-2764 (2007).
- Falco, R. C., Fish, D. A comparison of methods for sampling the deer tick, Ixodes dammini, in a Lyme disease endemic area. Experimental & Applied Acarology. 14 (2), 165-173 (1992).
- Patrick, C. D., Hair, J. A. Laboratory rearing procedures and equipment for multi-host ticks (Acarina: Ixodidae). Journal of Medical Entomology. 12 (3), 389-390 (1975).
- Köchl, S., Niederstätter, H., Parson, W. DNA extraction and quantitation of forensic samples using the phenol-chloroform method and real-time PCR. Methods in Molecular Biology. 297, 13-30 (2005).
- Wallace, D. M., Berger, S. L., Kimmel, R. Large- and small- scale phenol extractions. Guide to molecular cloning techniques. 18, 33-41 (1987).
- Zeugin, J. A., Hartley, J. L. Ethanol Precipitation of DNA. Focus. 7 (4), 1-2 (1985).
- Walsh, P. S., Metzger, D. A., Higuchi, R. Chelex 100 as a medium for simple extraction of DNA for PCR-based typing from forensic material. BioTechniques. 10, 506-518 (1991).
- Gariepy, T. D., Lindsay, R., Ogden, N., Gregory, T. R. Identifying the last supper: utility of the DNA barcode library for bloodmeal identification in ticks. Molecular Ecology Resources. 12, 646-652 (2012).
- Ammazzalorso, A. D., Zolnik, C. P., Daniels, T. J., Kolokotronis, S. O. To beat or not to beat a tick: comparison of DNA extraction methods for ticks (Ixodes scapularis). PeerJ. 3, 1-14 (2015).
- Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. Journal of Visualized Experiments. , (2010).
- TaKara Bio. . Library Quantification Kit: User Manual. , (2018).
- Genohub. . Cluster density optimization on Illumina sequencing instruments. , (2018).
- Fadrosh, D. W., et al. An improved dual-indexing approach for multiplexed 16S rRNA gene sequencing on the Illumina MiSeq platform. Microbiome. 2 (6), (2014).
- Caporaso, G. J., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature Methods. 7, 335-336 (2010).
- Schloss, P. D., et al. Introducing mothur: open-source, platform-independent, community-supported software for describing and comparing microbial communities. Applied and Environmental Microbiology. 75, 7537-7541 (2009).
- Duguma, D., et al. Developmental succession of the microbiome of Culex mosquitoes Ecological and evolutionary microbiology. BMC Microbiology. 15 (1), 1-13 (2015).
- Fagen, J. R. Characterization of the Relative Abundance of the Citrus Pathogen Ca. Liberibacter Asiaticus in the Microbiome of Its Insect Vector, Diaphorina citri, using High Throughput 16S rRNA Sequencing. The Open Microbiology Journal. 6 (1), 29-33 (2012).
- Geiger, A., et al. First isolation of Enterobacter, Enterococcus, and Acinetobacter spp. as inhabitants of the tsetse fly (Glossina palpalis palpalis) midgut. Infection, Genetics and Evolution. 9 (6), 1364-1370 (2009).
- Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biology. 12 (1), 1-12 (2014).
- Rand, K. H., Houck, H. Taq polymerase contains bacterial DNA of unknown origin. Molecular and Cellular Probes. 4, 445-450 (1990).
- Grahn, N., Olofsson, M., Ellnebo-Svedlund, K., Monstein, H. J., Jonasson, J. Identification of mixed bacterial DNA contamination in broad-range PCR amplification of 16S rDNA V1 and V3 variable regions by pyrosequencing of cloned amplicons. FEMS Microbiology Letters. 219, 87-91 (2003).
- Mohammadi, T., Reesink, H. W., Vandenbroucke-Grauls, C. M., Savelkoul, P. H. Removal of contaminating DNA from commercial nucleic acid extraction kit reagents. Journal of Microbiological Methods. 61, 285-288 (2005).
- Weiss, S., Amir, A., Hyde, E. R., Metcalf, J. L., Song, S. J., Knight, R. Tracking down the sources of experimental contamination in microbiome studies. Genome Biology. 15, 564 (2014).
- Paulson, J. N., Stine, O. C., Bravo, H. C., Pop, M. Differential abundance analysis for microbial marker-gene surveys. Nature Methods. 10 (12), 1200-1202 (2013).
- Weiss, S., et al. Normalization and microbial differential abundance strategies depend upon data characteristics. Microbiome. 5 (1), 1-18 (2017).
- McMurdie, P. J., Holmes, S. Waste Not, Want Not: Why Rarefying Microbiome Data Is Inadmissible. Public Library of Science Computational Biology. 10 (4), (2014).
- Edmonds, K., Williams, L. The role of the negative control in microbiome analyses. The Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 23 (Suppl 1), (2017).
- Gall, C. A., et al. The bacterial microbiome of Dermacentor andersoni ticks influences pathogen susceptibility. The ISME Journal: Multidisciplinary Journal of Microbial Ecology. 10, 1846-1855 (2016).
- Gofton, A. W., et al. Inhibition of the endosymbiont "Candidatus Midichloria mitochondrii" during 16S rRNA gene profiling reveals potential pathogens in Ixodes ticks from Australia. Parasites & Vectors. , 1-11 (2015).
- Pruesse, E., et al. SILVA: a comprehensive online resource for quality checked and aligned ribosomal RNA sequence data compatible with ARB. Nucleic Acids Research. 35, 7188-7196 (2007).
- DeSantis, T. Z., et al. Greengenes, a chimera-checked 16S rRNA gene database and workbench compatible with ARB. Applied and Environmental Microbiology. 72, 5069-5072 (2006).
- Cole, J. R., et al. The Ribosomal Database Project: improved alignments and new tools for rRNA analysis. Nucleic Acids Research. 37, D141-D145 (2009).
- Benson, D. A., Karsch-Mizrachi, I., Lipman, D. J., Ostell, J., Wheeler, D. L. GenBank. Nucleic Acids Research. 34, D16-D20 (2006).
- Schloss, P. D. The effects of alignment quality, distance calculation method, sequence filtering, and region on the analysis of 16S rRNA gene-based studies. Public Library of Science Computational Biology. 6 (7), 19 (2010).
- Balvočiute, M., Huson, D. H., SILVA, R. D. P. Greengenes, NCBI and OTT – how do these taxonomies compare?. BMC Genomics. 18 (Suppl 2), 1-8 (2017).
- Langille, M. G., et al. Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences. Nature Biotechnology. 31 (9), 814-821 (2013).
