Karakterisering van het Microbiome van de teek door Next-Generation 16S rRNA Amplicon sequentiebepaling
Summary
Hier presenteren we een volgende-generatie sequencing-protocol voor het 16S rRNA rangschikken waarmee identificatie en karakterisering van microbiële gemeenschappen binnen de vectoren. Deze methode houdt het DNA-extractie, versterking en barcoding van monsters door middel van PCR, rangschikking op een stroom-cel, en bio-informatica aan sequencedata tot fylogenetische informatie.
Abstract
In de afgelopen decennia hebben vector-overgedragen ziekten weer naar voren en uitgebreid op alarmerend tarieven, veroorzaken aanzienlijke morbiditeit en mortaliteit wereldwijd. Effectieve en wijd-beschikbaar vaccins ontbreken voor een meerderheid van deze ziekten, waardoor de ontwikkeling van nieuwe ziekte risicobeperkende strategieën. Te dien einde houdt een veelbelovende laan van ziektebestrijding gericht op de vector microbiome, de Gemeenschap van microben bevolken de vector. De vector microbiome speelt een centrale rol in pathogen dynamiek en manipulaties van de microbiome hebben geleid tot verminderde vector overvloed of pathogen transmissie voor een handvol vector-overgedragen ziekten. Het vertalen van deze bevindingen in disease control toepassingen vereist echter een gedegen kennis van vector microbiële ecologie, historisch beperkt door onvoldoende technologie op dit gebied. De komst van de volgende generatie sequencing benaderingen heeft snelle, zeer parallelle sequencing van cultuurgemeenschappen microbiële ingeschakeld. Gericht op het zeer geconserveerd 16S rRNA gen heeft vergemakkelijkt karakterisaties van microben in vectoren onder variërende ecologische en experimentele voorwaarden aanwezig. Deze techniek gaat om versterking van het 16S rRNA gen, monster barcoding via PCR, laden monsters naar een cel van de stroom voor het rangschikken, en bio-informatica benaderingen aan sequencedata met fylogenetische informatie. Soort of geslacht-niveau identificatie voor een groot aantal replicatieonderzoeken kan meestal worden bereikt door deze aanpak, dus het omzeilen van uitdagingen van loeien speurder, resolutie en uitvoer van traditionele kweken, microscopie of histologische kleuring technieken. Daarom deze methode is geschikt voor het karakteriseren van vector microben onder uiteenlopende omstandigheden, maar op dit moment geen informatie worden verkregen op microbiële functie, locatie binnen de vector of reactie op de behandeling met antibiotica. Over het geheel genomen is 16S volgende-generatie rangschikken een krachtige techniek voor het beter begrijpen van de identiteit en de rol van vector microben in de dynamiek van de ziekte.
Introduction
De heropleving en de verspreiding van de vector-overgedragen ziekten in de afgelopen decennia bedreiging een ernstige voor globale gezondheid van mensen en dieren in het wild. Effectieve vaccins ontbreken voor een meerderheid van deze ziekten, en controle-inspanningen worden belemmerd door de complexe biologische aard van vectoren en vector-gastheer interacties. Inzicht in de rol van microbiële interacties binnen een vector in pathogen transmissie kan zorgen voor de ontwikkeling van nieuwe strategieën die het omzeilen van deze uitdagingen. In het bijzonder, interacties tussen vector-geassocieerde microbiële commensals, symbionten en ziekteverwekkers, hierna aangeduid als de microbiome, kunnen belangrijke gevolgen hebben voor pathogen transmissie. Overweldigend bewijs nu ondersteunt deze bewering, met voorbeelden waaruit blijkt van een koppeling tussen de vector microbiome en bekwaamheid voor ziekten zoals malaria, Zika-virus en de ziekte van Lyme1,2,3. Het vertalen van deze bevindingen in strategieën voor ziektepreventie en-bestrijding vereist echter een veel gedetailleerder inzicht in de structuur, functie en herkomst van de vector microbiomes. Identificatie en karakterisering van de microbiële Gemeenschap van vector onder variërende ecologische en experimentele omstandigheden vormen een belangrijke weg vooruit op dit gebied.
Een procedure voor de identificatie van de microbiële bewoners van een ziekteverwekker vector is hier geboden door gebruik te maken van de westerse zwart-legged teek, Ixodes pacificus, een vector soorten van de verwekker van de ziekte van Lyme Borrelia burgdorferi. Terwijl teken meer soorten menselijke pathogenen dan elke andere arthropod haven, is relatief weinig bekend over de ecologie van de biologie en de Gemeenschap van de teek microbiomes4. Het is duidelijk dat teken haven een divers scala aan virussen, bacteriën, schimmels en protozoa, waaronder commensals, endosymbionten en voorbijgaande microbiële bewoners5,4. Voorafgaande werk heeft aangetoond sterke variaties in de Ixodes microbiomes geografie, soort, geslacht, leven stadium en bloedmeel bron6,7,8is gekoppeld. Nochtans, de mechanismen die ten grondslag liggen aan deze variatie onbekend blijven en garandeert u dat meer gedetailleerde onderzoek van de oorsprong en samenstelling van deze microbiële gemeenschappen. Teken kunnen verwerven microben via verticale transmissie, contact met hosts en opname van het milieu door middel van de spiracles, mond en anale poriën9. Inzicht in de factoren die het vormgeven van de initiële vorming en ontwikkeling van de microbiome van de teek, is specifiek de relatieve bijdrage van verticale en milieu transmissie, belangrijk voor het begrip van de natuurlijke patronen en variaties in de teek microbiome diversiteit en de wisselwerking van deze gemeenschappen tijdens pathogen transmissie, met mogelijke toepassingen aan ziekte of vector.
Krachtige moleculaire technieken, zoals de sequencing van de volgende generatie, nu bestaan voor de identificatie van microbiële gemeenschappen en kunnen worden gebruikt om te karakteriseren vector microbiomes onder uiteenlopende milieu- of experimentele omstandigheden. Voorafgaand aan de komst van deze high-throughput sequencing benaderingen, de identificatie van microben ingeroepen overwegend microscopie en cultuur. Terwijl microscopie een snelle en gemakkelijke techniek is, zijn morfologische methoden voor het identificeren van microben inherent subjectief en grof en beperkt door lage gevoeligheid en detectie10. Cultuur gebaseerde methoden zijn over het algemeen gebruikt voor microbiële identificatie en kunnen worden gebruikt voor het bepalen van de gevoeligheid van bacteriën voor drug behandelingen11. Echter, deze methode ook lijdt aan lage gevoeligheid, als er wordt geschat dat minder dan 2% van milieu microben kunnen worden gekweekt in een laboratorium, instelling van12. Histologische kleuring benaderingen zijn ook tewerkgesteld te detecteren en lokaliseren specifieke microben binnen vectoren, onderzoek van verschillende taxa distributies binnen de teek mogelijk te maken en studeren hypothesen over microbiële interacties. Voorafgaande kennis van microbiële identiteit is echter vereist voor het selecteren van de juiste vlekken, maken deze aanpak niet geschikt voor microbiële karakterisering en de identificatie. Anderzijds histologische kleuring is een zeer tijdrovende en moeizame proces en niet schaalt ook bij grote steekproeven. Traditionele moleculaire benaderingen zoals Sanger sequencing zijn ook beperkt in hun gevoeligheid en opsporen van microbiële cultuurgemeenschappen.
Volgende-generatie sequencing zorgt voor de snelle identificatie van microben uit een groot aantal monsters. De aanwezigheid van standaard-markers en verwijzing databases verdere hiermee verbeterd taxonomische resolutie, vaak naar het geslacht of de soort niveau. Kleine subeenheid ribosomaal RNAs worden vaak gebruikt om dit te bereiken, met 16S rRNA worden de meest voorkomende als gevolg van de aanwezigheid van geconserveerde en variabele regio’s binnen het gen, waardoor voor de totstandbrenging van universele inleidingen met unieke waarbij voor elk bacteriële soorten13,14. Dit verslag beschrijft in detail een procedure voor de identificatie van taxa in de microbiome van de teek door 16S rRNA volgende-generatie sequencing. Dit protocol onderstreept met name de stappen die betrokken zijn bij de voorbereiding van monsters voor het rangschikken. Meer algemene informatie over de volgorde en bioinformatics stappen dienen, aangezien er een verscheidenheid van sequencing platformen en analyse programma’s die momenteel beschikbaar, elk met uitgebreide bestaande documentatie. De algehele haalbaarheid van deze next-generation sequencing aanpak wordt aangetoond door het toe te passen op een onderzoek van microbiële Gemeenschap vergadering binnen een belangrijke ziekte vector.
Protocol
Representative Results
Discussion
Volgende-generatie sequentiebepaling van het 16S rRNA is geworden van een standaardaanpak voor microbiële identificatie en de studie van de invloed van vector microbiomes op pathogen transmissie ingeschakeld. Het protocol hier geschetste details het gebruik van deze methode te onderzoeken van de microbiële Gemeenschap vergadering in I. pacificus, een vector soorten voor de ziekte van Lyme; het kan echter gemakkelijk worden toegepast om te bestuderen van andere geleedpotigen vector of teek soorten.
<p class…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door National Science Foundation verleent aan A.S. (DEB #1427772, 1745411, 1750037).
Materials
| Item | Name of Material/Equipment | Company | Catalog # |
| 1 | DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 |
| 2 | Qubit 4 Fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q3326 |
| 3 | NanoDrop 8000 Spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-8000-GL |
| 4 | 2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix | Kapa Biosystems | KK2501 |
| 5 | AMPure XP beads | Agen Court | A63880 |
| 6 | Magnetic Rack | ThermoFisher Scientific | MR02 |
| 6 | TE buffer | Teknova | T0223 |
| 7 | Nextera Index Kit | Illumina | FC-121-1011 |
| 8 | KAPA Library Quantification Kit | Roche | KK4824 |
| 9 | MiSeq System | Illumina | SY-410-1003 |
| 10 | MiSeq Reagent Kit v3 | Illumina | MS-102-3001 |
| 11 | 10 mM Tris-HCl with 0.1% Tween 20 | Teknova | T7724 |
References
- Dong, Y., Manfredini, F., Dimopoulos, G. Implication of the mosquito midgut microbiota in the defense against malaria parasites. Public Library of Science Pathogens. 5 (5), (2009).
- Aliota, M. T., Peinado, S. A., Velez, I. D., Osorio, J. E. The wMel strain of Wolbachia reduces transmission of Zika virus by Aedes aegypti. Scientific Reports. 6 (July), 1-7 (2016).
- Narasimhan, S., et al. Gut microbiota of the tick vector Ixodes scapularis modulate colonization of the Lyme disease spirochete. Cell Host and Microbe. 15 (1), 58-71 (2014).
- Clay, K., Fuqua, C. The Tick Microbiome: Diversity, Distribution and Influence of the Internal Microbial Community for a Blood-Feeding Disease Vector. Critical Needs and Gaps in Understanding Prevention, Amelioration, and Resolution of Lyme and Other Tick-Borne Diseases: The Short-Term and Long-Term Outcomes. , 1-22 (2010).
- Noda, H., Munderloh, U. G., Kurtti, T. J. Endosymbionts of Ticks and Their Relationship to Wolbachia spp. and Tick-Borne Pathogens of Humans and Animals. Applied and Environmental Microbiology. 63 (10), 3926-3932 (1997).
- van Treuren, W., et al. Variation in the microbiota of Ixodes ticks with regard to geography, species, and sex. Applied and Environmental Microbiology. 81 (18), 6200-6209 (2015).
- Swei, A., Kwan, J. Y. Tick microbiome and pathogen acquisition altered by host blood meal. The ISME Journal: Multidisciplinary Journal of Microbial Ecology. 11 (3), 813-816 (2017).
- Kwan, J. Y., Griggs, R., Chicana, B., Miller, C., Swei, A. Vertical vs. horizontal transmission of the microbiome in a key disease vector, Ixodes pacificus. Molecular Ecology. 26 (23), 6578-6589 (2017).
- Narasimhan, S., Fikrig, E. Tick microbiome: The force within. Trends in Parasitology. 31 (7), 315-323 (2015).
- Houpikian, P., Raoult, D. Traditional and molecular techniques for the study of emerging bacterial diseases: One laboratory’s perspective. Emerging Infectious Diseases. 8 (2), 122-131 (2002).
- Kotsilkov, K., Popova, C., Boyanova, L., Setchanova, L., Mitov, I. Comparison of culture method and real-time PCR for detection of putative periodontopathogenic bacteria in deep periodontal pockets. Biotechnology and Biotechnological Equipment. 29 (5), 996-1002 (2015).
- Wade, W. Unculturable bacteria – The uncharacterized organisms that cause oral infections. Journal of the Royal Society of Medicine. 95 (2), 81-83 (2002).
- Klindworth, A., et al. Evaluation of general 16S ribosomal RNA gene PCR primers for classical and next-generation sequencing-based diversity studies. Nucleic Acids Research. 41 (1), 1-11 (2013).
- Janda, J. M., Abbott, S. L. 16S rRNA gene sequencing for bacterial identification in the diagnostic laboratory: Pluses, perils, and pitfalls. Journal of Clinical Microbiology. 45 (9), 2761-2764 (2007).
- Falco, R. C., Fish, D. A comparison of methods for sampling the deer tick, Ixodes dammini, in a Lyme disease endemic area. Experimental & Applied Acarology. 14 (2), 165-173 (1992).
- Patrick, C. D., Hair, J. A. Laboratory rearing procedures and equipment for multi-host ticks (Acarina: Ixodidae). Journal of Medical Entomology. 12 (3), 389-390 (1975).
- Köchl, S., Niederstätter, H., Parson, W. DNA extraction and quantitation of forensic samples using the phenol-chloroform method and real-time PCR. Methods in Molecular Biology. 297, 13-30 (2005).
- Wallace, D. M., Berger, S. L., Kimmel, R. Large- and small- scale phenol extractions. Guide to molecular cloning techniques. 18, 33-41 (1987).
- Zeugin, J. A., Hartley, J. L. Ethanol Precipitation of DNA. Focus. 7 (4), 1-2 (1985).
- Walsh, P. S., Metzger, D. A., Higuchi, R. Chelex 100 as a medium for simple extraction of DNA for PCR-based typing from forensic material. BioTechniques. 10, 506-518 (1991).
- Gariepy, T. D., Lindsay, R., Ogden, N., Gregory, T. R. Identifying the last supper: utility of the DNA barcode library for bloodmeal identification in ticks. Molecular Ecology Resources. 12, 646-652 (2012).
- Ammazzalorso, A. D., Zolnik, C. P., Daniels, T. J., Kolokotronis, S. O. To beat or not to beat a tick: comparison of DNA extraction methods for ticks (Ixodes scapularis). PeerJ. 3, 1-14 (2015).
- Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. Journal of Visualized Experiments. , (2010).
- TaKara Bio. . Library Quantification Kit: User Manual. , (2018).
- Genohub. . Cluster density optimization on Illumina sequencing instruments. , (2018).
- Fadrosh, D. W., et al. An improved dual-indexing approach for multiplexed 16S rRNA gene sequencing on the Illumina MiSeq platform. Microbiome. 2 (6), (2014).
- Caporaso, G. J., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature Methods. 7, 335-336 (2010).
- Schloss, P. D., et al. Introducing mothur: open-source, platform-independent, community-supported software for describing and comparing microbial communities. Applied and Environmental Microbiology. 75, 7537-7541 (2009).
- Duguma, D., et al. Developmental succession of the microbiome of Culex mosquitoes Ecological and evolutionary microbiology. BMC Microbiology. 15 (1), 1-13 (2015).
- Fagen, J. R. Characterization of the Relative Abundance of the Citrus Pathogen Ca. Liberibacter Asiaticus in the Microbiome of Its Insect Vector, Diaphorina citri, using High Throughput 16S rRNA Sequencing. The Open Microbiology Journal. 6 (1), 29-33 (2012).
- Geiger, A., et al. First isolation of Enterobacter, Enterococcus, and Acinetobacter spp. as inhabitants of the tsetse fly (Glossina palpalis palpalis) midgut. Infection, Genetics and Evolution. 9 (6), 1364-1370 (2009).
- Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biology. 12 (1), 1-12 (2014).
- Rand, K. H., Houck, H. Taq polymerase contains bacterial DNA of unknown origin. Molecular and Cellular Probes. 4, 445-450 (1990).
- Grahn, N., Olofsson, M., Ellnebo-Svedlund, K., Monstein, H. J., Jonasson, J. Identification of mixed bacterial DNA contamination in broad-range PCR amplification of 16S rDNA V1 and V3 variable regions by pyrosequencing of cloned amplicons. FEMS Microbiology Letters. 219, 87-91 (2003).
- Mohammadi, T., Reesink, H. W., Vandenbroucke-Grauls, C. M., Savelkoul, P. H. Removal of contaminating DNA from commercial nucleic acid extraction kit reagents. Journal of Microbiological Methods. 61, 285-288 (2005).
- Weiss, S., Amir, A., Hyde, E. R., Metcalf, J. L., Song, S. J., Knight, R. Tracking down the sources of experimental contamination in microbiome studies. Genome Biology. 15, 564 (2014).
- Paulson, J. N., Stine, O. C., Bravo, H. C., Pop, M. Differential abundance analysis for microbial marker-gene surveys. Nature Methods. 10 (12), 1200-1202 (2013).
- Weiss, S., et al. Normalization and microbial differential abundance strategies depend upon data characteristics. Microbiome. 5 (1), 1-18 (2017).
- McMurdie, P. J., Holmes, S. Waste Not, Want Not: Why Rarefying Microbiome Data Is Inadmissible. Public Library of Science Computational Biology. 10 (4), (2014).
- Edmonds, K., Williams, L. The role of the negative control in microbiome analyses. The Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 23 (Suppl 1), (2017).
- Gall, C. A., et al. The bacterial microbiome of Dermacentor andersoni ticks influences pathogen susceptibility. The ISME Journal: Multidisciplinary Journal of Microbial Ecology. 10, 1846-1855 (2016).
- Gofton, A. W., et al. Inhibition of the endosymbiont "Candidatus Midichloria mitochondrii" during 16S rRNA gene profiling reveals potential pathogens in Ixodes ticks from Australia. Parasites & Vectors. , 1-11 (2015).
- Pruesse, E., et al. SILVA: a comprehensive online resource for quality checked and aligned ribosomal RNA sequence data compatible with ARB. Nucleic Acids Research. 35, 7188-7196 (2007).
- DeSantis, T. Z., et al. Greengenes, a chimera-checked 16S rRNA gene database and workbench compatible with ARB. Applied and Environmental Microbiology. 72, 5069-5072 (2006).
- Cole, J. R., et al. The Ribosomal Database Project: improved alignments and new tools for rRNA analysis. Nucleic Acids Research. 37, D141-D145 (2009).
- Benson, D. A., Karsch-Mizrachi, I., Lipman, D. J., Ostell, J., Wheeler, D. L. GenBank. Nucleic Acids Research. 34, D16-D20 (2006).
- Schloss, P. D. The effects of alignment quality, distance calculation method, sequence filtering, and region on the analysis of 16S rRNA gene-based studies. Public Library of Science Computational Biology. 6 (7), 19 (2010).
- Balvočiute, M., Huson, D. H., SILVA, R. D. P. Greengenes, NCBI and OTT – how do these taxonomies compare?. BMC Genomics. 18 (Suppl 2), 1-8 (2017).
- Langille, M. G., et al. Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences. Nature Biotechnology. 31 (9), 814-821 (2013).
